Цитохимия крови анализ

Цитохимия крови анализ

Перед началом цитохимических исследований производится морфологический анализ окрашенных по Романовскому- Гимзе или Май-Грюнвальду мазков костного мозга и/или периферической крови. Для осуществления цитохимической диагностики лейкозов широко используются следующие цитохимические реакции:

Определение содержания полисахаридов в PAS-реакции по методам McManus (1946), R. D. Hotchkiss (1948) (Лецкий В. Б., 1973; Глузман Д. Ф. и др., 2000 ).

Определение содержания фосфолипидов в реакции с Суданом черным Б, по методам Shneehan и Storey (1947); Ackerman (1952).

Определение активности миелопероксидазы по методу Sato (1928) и Quaglino (1958), W. Loele (1936) (Глузман Д. Ф. и др., 2000; Лецкий В. Б., 1973 ).

Определение активности хлорацетат-эстеразы по методу Moloney с соавт. (1960).

Определение активности кислой фосфатазы по методам Р. П. Нарциссова (1968); Гольдберга и Барка (1962); Берстона (1958).

Определение активности а-нафтилацетат-эстеразы по методам Хейхо с соавт. (1964); Э. Пирса (1960) в модификации Леф-флера(1961).

Определение активности щелочной фосфатазы по методам Kaplow (1955); Ф. Г. Дж. Хейхо. Д. К. Кваглино (1958); М. Г. Шу-бич (1967) (ЛецкийВ. Б., 1973; Глузман Д. Ф. и др., 2000; Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К, 1983).

Общепринятый способ оценки реакции в световом микроскопе был предложен Kaplow в 1955 г. и в 1957 г. модифицирован Асталь-ди и Верга. Он основан на оценке интенсивности реакции. Прежде всего в окрашенном препарате подсчитывают не менее 100 исследуемых клеток. При острых лейкозах оценку реакции проводят в бластных элементах; определяют процент положительно реагирующих клеток (ППК), а также средний цитохимический коэффициент окраски (СЦК).

Реакция считается положительной при наличии 3 и более процентов клеток, в которых выявлена положительная реакция, при этом количество клеток с положительной окраской может колебаться от 3 до 100%.

Вторым показателем реакции является интенсивность окраски, которая отражает активность фермента или количество исследуемого вещества в клетке. Она выражается средним цитохимическим коэффициентом — СЦК. Для его вычисления учитывают различную степень интенсивности окраски клеток. При подсчете 100 клеточных элементов любого типа различают 4 степени реакции: 0 (нулевая) — с отрицательной реакцией; I — со слабоположительной реакцией; II — с положительной реакцией; III — с выраженной реакцией.

При 0 (нулевой) степени интенсивности окраски окрашивание клеток отсутствует.

При I степени интенсивности окраски имеют место единичные окрашенные гранулы в цитоплазме, либо слабое диффузное окрашивание всей цитоплазмы, либо наличие небольшого окрашенного участка — фокусное или локальное окрашивание.

При II степени интенсивности окраски наблюдается заполнение окрашенными зернами или диффузно почти всей цитоплазмы, но неокрашенные ее участки имеются.

При III степени окраски интенсивно окрашенные гранулы заполняют всю цитоплазму, иногда частично покрывая ядро. При диффузном характере реакции наблюдается очень яркая интенсивная реакция во всей цитоплазме. Таким образом, СЦК свидетельствует, как уже было сказано, о содержании вещества или о его активности в клетке.

Пример: из 100 подсчитанных клеток одного типа (бластных клеток при остром лейкозе) 50 клеток реагировали отрицательно и 50 клеток — положительно. При этом окрашенные клетки распределились по степени интенсивности окраски следующим образом: I степень — 30 клеток; II степень — 18 клеток; III степень -2 клетки.

Согласно формуле:

При оценке реакции, особенно при отсутствии окрашивания клеток, необходимо быть уверенным, что нулевая степень интенсивности окраски не зависит от качества реакции. Поэтому надо обязательно найти в. мазке положительно реагирующие клетки любого типа. В противном случае реакцию нужно повторять.

Для оценки реакции ориентируются на нормальные цитохимические показатели клеток здоровых людей (Лецкий В. Б., 1973).

Острые миелоидныё лейкозы (ОМЛ)*

Авторы ФАБ-классификации острых миелобластных лейкозов выделяют 3 типа миелобластов при ОМЛ: I- клетки с узкой голубой или базофильной, не содержащей азурофильных гранул, цитоплазмой, ядром с нежнозернистой структурой хроматина и одной крупной нуклеолой; II — клетки с 2-4 мелкими нуклеолами, отличаются более широкой цитоплазмой, содержащей от нескольких до 20 азурофильных гранул; III -в периферической крови и костном мозге больных ОМЛ иногда выявляют бласты с многочисленными азурофильными гранулами; наличие таких бластов в некоторых случаях ОМЛ с созреванием (М2) коррелирует с транслокацией t(8;21) (Bennet J. M. et al, 1985).

Острый миелобластный лейкоз с минимальной дифферен-цировкой (ОМЛ МО), или острый недифференцируемый лейкоз характеризуется отрицательными реакциями на МП, липиды, ХАЭ и КФ. Может наблюдаться слабоположительная PAS-реакция типичного для ОМЛ диффузного или мелкогранулярного характера. Очень редко в небольшом количестве бластов выявляется слабая, не подавляемая фторидом натрия реакция на осНАЭ (Cuneo A. et al, 1995). Морфологические особенности бластных клеток при МО преимущественно I типа неоднородны, но преобладают клетки среднего диаметра. Их содержание может достигать 95%. Характерные только для этой формы лейкоза хромосомные аберрации не выявлены (Воробьев А. И. и др., 2002). МО диагностируется по результатам иммунофенотипирования — наличия маркеров CD13, CD33, CD34, CD117 (Bene M. С. et al, 1998). Дифференциальная диагностика проводится с ОМЛ М7 и ОЛЛ.

Острый миелобластный лейкоз без созревания (ОМЛ М1) характеризуется наличием в пунктате костного мозга более 90% бластных клеток. Наблюдаются преимущественно бласты I типа, без зернистости. Азурофильная зернистость определяется менее чем в 10% бластов. Согласно Д. Ф. Глузман и соавторам (2000), палочки Ауэра обнаруживаются приблизительно у 50% больных ОМЛ Ml. По нашим наблюдениям, палочки Ауэра при этом варианте лейкоза отсутствуют. Властные клетки характеризуются средними и крупными размерами, округлыми, иногда неправильной формы ядрами с 1-4 нуклеолами и нежнозернистой структурой ядерного хроматина. Иммунофенотип бластов включает CD33, CD13, CD117, CD14, CD64, CD15, HLA-DR и МПО, реже CD34, CD117 (Bene M. С. et al, 1998). Дифференциальный диагноз проводится с ОМЛ М2, ОМЛ М5, ОМЛ М7 и ОЛЛ.

Острый миелобластный лейкоз с созреванием (ОМЛ М2) отличается от ОМЛ Ml меньшим содержанием бластных клеток в пунктате костного мозга (менее 89% бластов). Властные клетки I и, главным образом, II типов характеризуются средними и крупными размерами и заметным полиморфизмом. Их ядра могут быть округлыми или неправильной формы. Структура ядерного хроматина тонкодисперсная. Значительная часть бластов содержит азуро-фильную зернистость (бласты II типа), встречаются палочки Ауэра, которые могут обнаруживаться в более зрелых гранулоцитах. Созревающие гранулоциты составляют более 10% клеток (Bennet J. M. et al., 1985). Иммунофенотипические маркеры при ОМЛ М2 -CD13, CD15, CD33, CD64, МПО, HLA-DR. Небольшое количество бластов экспрессирует CD34 и CD117 (Воробьев А. И. и др., 2002; Бене М. К. и др., 1996).

Для этих двух вариантов ОМЛ характерна положительная реакция бластов на миелопероксидазу липиды и ХАЭ, которые являются маркерными для миелобластов. Выраженность реакции в бла-стах на МП вариабельна, по нашим наблюдениям, она колеблется от 7 до 100% МП позитивных клеток. При ОМЛ М2 процент клеток, положительно реагирующих в реакции на МП, липиды и ХАЭ, значительно выше, чем при ОМЛ без созревания — Ml. Миелопер-оксидаза выявляется в цитоплазме в виде гранул золотисто-желтого цвета при использовании в реакции ортотолидина или в виде гранул темно-синего цвета при использовании бензидина. Количество гранул различно от случая к случаю — от небольшого их числа в одном участке цитоплазмы до полного ее заполнения. Реакция на МП, как и реакция на липиды, часто лучше выявляет палочки Ауэра, чем обычная паноптическая окраска. Согласно нашим наблюдениям и сообщениям других авторов (Френкель М. А, 1999), у части больных ОНЛЛ (Ml, M2) могут выявляться только один или два цитохимических маркера. В ряде случаев при отсутствии в бластах МП большая часть зрелых нейтрофилов может быть также пероксидазоотрицательна. В процессе лечения клетки иногда утрачивают фермент.

Вторая маркерная реакция для ОМЛ с созреванием и без созревания — реакция на липиды с Суданом черным Б. По мнению некоторых исследователей и согласно нашим наблюдениям, она даже более надежна, чем миелопероксидаза (Ковалева Л. Г., 1990). Фос-фолипиды выявляются в 14-100% бластов в виде черных гранул, которые часто заполняют всю цитоплазму клетки. Интенсивность реакции различна.

Реакция на гранулоцитарную эстеразу ХАЭ также является маркерной для нейтрофилов, но имеет меньшее значение в диагностике, особенно для ОМЛ Ml, так как фермент начинает выявляться в основном со стадии промиелоцита. По мере созревания клеток активность фермента снижается. Реакция на полисахариды не имеет особого диагностического значения. В миелобластах PAS-положительное вещество может отсутствовать или иметь диффузный или диффузномелкогранулярный характер распределения. Мелкие, реже средние гранулы темно-малинового цвета беспорядочно располагаются на фоне диффузно окрашенной бледно-розовой цитоплазмы.

Реакция на а-нафтилацетат-эстеразу способствует дифференциальной диагностике ОМЛ Ml и ОМЛ М2 с острыми моноцитар-ными лейкозами. Она может быть отрицательной в миелобластах, однако в случае положительной реакции диагностическое значение имеет отсутствие ингибиции реакции в миелобластах фторидом натрия в отличие от монобластов, в которых она подавляется ингибитором.

Фермент выявляется в виде буровато-коричневых гранул (при использовании в реакции синего прочного В или ВВ) на фоне диффузного окрашивания цитоплазмы.

Кислая фосфатаза не имеет диагностического значения для этих двух вариантов ОМЛ. При наличии положительной реакции необходимо обратить внимание на взаимодействие фермента с ингибитором — ионами тартрата. В отличие от моноцитарных клеток реакция в бластных клетках при мнелобластных лейкозах не подавляется тартратом натрия.

Очень редкий вариант ОМЛ М2 — острый базофильный лейкоз (классификация ВОЗ, 2000,2002) — характеризуется содержанием более 5% базофилов от неэритроидной популяции костного мозга. При этом типе ОМЛ выявляется транслокация t(6;9)(p23;q34) и делеция или транслокация короткого плеча хромосомы 12. Выделяют редкий вариант этого лейкоза, содержащий вариабельное, иногда значительное, количество базофильных клеток различной степени зрелости. Клетки характеризуются средним диаметром и неширокой голубой цитоплазмой. Ядра могут иметь неправильную форму; ядрышки, как это свойственно базофилам, почти не видны. В бластах выявляется крупная базофильная зернистость. Реакция на МП, липиды и гранулоцитарную эстеразу отрицательная, но положительная с альциановым синим (Френкель М. А, 1999). PAS-реакция в виде крупных гранул и блоков. Пунктат костного мозга малоклеточный, кроме базофильных бластов в нем обнаруживают более зрелые клетки этого ряда.

Острый промиелоцитарный лейкоз (ОМЛ МЗ). Особый тип бластнвгх клеток наблюдается при остром промиелоцитарном лейкозе (ОПЛ, или ОМЛ МЗ). Это название было дано из-за наличия в лейкемических клетках обильной зернистости. Властные клетки, или атипичные промиелоциты при ОПЛ характеризуются выраженным полиморфизмом и анаплазией. Их ядра имеют неправильную форму, часто лопастную, двудольчатую, складчатую и могут располагаться эксцентрично. Цитоплазма — от голубого до базо-фильного цвета, иногда имеет выросты. В ней выявляется обильная зернистость 2 типов: грубые крупные темно-фиолетовые грапулы IT более мелкие пурпурного цвета. Гранулы заполяют цитоплазму и иногда покрывают ядро клетки. Как правило, бласты содержат палочки Ауэра, иногда в виде пучков. Кроме этих бластов наблюдаются клетки с мелкой зернистостью и не более 8-10% обычных миелобластов. Это типичный макрогранулярный вариант ОПЛ.

Нетипичный, редкий микрогранулярный вариант этого лейкоза — О МЛ M3v — характеризуется бластами с очень скудной, мелкой, иногда пылевидной зернистостью. Палочки Ауэра немногочисленны. При этом варианте ОПЛ бласты отличаются уродливостью ядер (бобовидные, двудольчатые, лопастные, рассеченные, с глубокими выемками) и могут напоминать бласты при остром мо-нобластном лейкозе с созреванием (ОМЛ М5в). Из-за этого сходства необходимо проводить дифференциальную диагностику между этими двумя типами лейкоза, тем более что своевременная диагностика ОПЛ важна в связи с возможностью достижения полной ремиссии под воздействием дериватов ретиноевой кислоты (Савченко В. Г. и др., 2001, а, о; Huang M.-E., 1988). Клетки при ОМЛ МЗ содержат главные маркеры миелоидных клеток — МП, липи-ды, ХАЭ в максимальных количествах. Даже реакции на а-нафтил-ацетат-эстеразу, не подавляемую фторидом натрия, и полисахариды значительно более выражены, чем в бластных клетках при Ml и М2 вариантах ОМЛ. Основываясь на нашем опыте, следует отметить, что интенсивность реакций на МП, ХАЭ и осНАЭ хотя и достаточно высокая, тем не менее в некоторых случаях M3v ниже, чем при макрогранулярном ОПЛ. При дифференциальной диагностике с монобластным лейкозом с созреванием помогает отсутствие миелоидных цитохимических маркеров или их слабая выраженность и яркая реакция на аНАЭ, подавляемую фторидом натрия в монобластах в отличие от бластов при ОПЛ (Bennet J. М. et al, 1976). Гранулы лейкозных клеток при ОПЛ содержат кислые сульфатированные мукополисахариды (Абду’лкадыров К. М. и др., 1978). С помощью цитогенетических исследований при ОПЛ обнаруживается транслокация t(15;17)(q22;ql2-21) и ряд других аберраций. Иммунофенотипически клетки ОПЛ характеризуются экспрессией антигенов CD13, CD33, МПО, CD64 и CD15. Клетки не несут антигены CD34, HLA-DR (Савченко В. Г. и др., 2001, а; Paietta E. et al., 1994).

Острый миеломонобластный лейкоз (ОММЛ, или М4) билинейный лейкоз, и его клеточный субстрат представлен клетками нейтрофилыгого и моноцитарного рядов, которые эксирессируют антигены обеих линий — CD13, CD14, CD15, CD33, CD34, CD64,

CDllc, CD117, CD4 и HLA-DR. Наиболее частые цитогенетичес-кие аберрации — t(9;ll), трисомия 4, t(l;7), t(8;21), связанные с Hq23. При этом варианте лейкоза обе клеточные линии характеризуются заметной дифференцировкой до зрелых форм. Сумма миелобластов I и II типов и монобластов в костном мозге обычно не превышает 60%, а на долю созревающих и зрелых гранулоцитов и моноцитов приходится в общей сложности от 20 до 40% клеток. Моноциты периферической крови составляют не менее 5 х 109/л. Цитохимически выявляются миелобласты, дающие положительную реакцию на МП, липиды, ХАЭ и монобласты, характеризующиеся присутствием в них моноцитарной а-нафтилацетат-эстера-зы, подавляемой фторидом натрия (Fischer R, Schmalze E, 1964) и КНЭ. Дифференциальный диагноз проводится с ОМ Л М2 и ОМ Л М5в.

Подвариантом билинейного типа ОММЛ является миеломоно-цитарный лейкоз с эозинофилией (М4эоз). Количество эоэинофи-лов в костном мозге составляет более 6%. Имеют место и характерные цитогенетические аберрации, в частности инверсия хромосомы 16 (pl3;q22) и t(16;16)(pl3;q22). Атипичные эозинофилы содержат крупные незрелые пурпурно-фиолетовые гранулы. Имеет место ядерная гиперсегментация. Эозинофилы дают положительную реакцию на полисахариды и ХАЭ. Властные клетки и даже зрелые нейтрофилы могут содержать палочки Ауэра.

Бифенотипичный вариант ОММЛ составляет около 1% случаев ОНЛЛ. При этом варианте лейкоза бласты содержат одновременно МП, липиды, ХАЭ и аНАЭ, подавляемую фторидом натрия. В таких случаях при диагностике проводят реакцию на двойную эстеразу — ХАЭ и аНАЭ. Здесь можно увидеть, что одни и те же клетки содержат цитохимические маркеры как неитрофильнои, так и моноцитарной линий.

Острый монобластный лейкоз (ОМоЛ, или М5) подразделяется на монобластный лейкоз без созревания (М5а) и с созреванием (М5в). При М5а-варианте более 80% клеток — монобласты. Это клетки большого диаметра с округлыми или овальными ядрами, 1-2 нуклеолами, с нежносетчатой структурой ядерного хроматина и достаточно широкой голубой или базофильной цитоплазмой. В части клеток наблюдается скудная пылевидная зернистость. В редких случаях можно видеть очень нежные, едва заметные палочки Ауэра. В бластах «содержится большое количество неспецифической эстеразы (аНАЭ и аНБЭ), подавляемой фторидом натрия и КНЭ. Неспецифическая эстераза, чувствительная к ингибитору, служит маркером моноцитов и монобластов и имеет большое значение для диагностики острых монобластных лейкозов, будучи высокоспецифичной для этих клеток. Положительная реакция выявляется в виде красновато- или буровато-коричневых обильных мелких гранул, заполняющих цитоплазму, поэтому иногда реакция кажется диффузной. Ингибиция реакции вариабельна — от частичной до тотальной. В отдельных монобластах выявляется слабая реакция на миелопероксидазу и липиды в виде редких рассеянных гранул. R. МсКеппа и соавторы (1975) описали несколько случаев монобластного лейкоза с высокой активностью аНАЭ, подавляемой фторидом натрия, и слабой активностью ХАЭ в большинстве клеток. Авторы считают, что в этих случаях бласт-ные клетки обладают свойствами моноцитарных и гранулоцитар-ных клеток. В литературе приводятся примеры аНАЭ негативных случаев ОМоЛ (Scott С. S. et al., 1993). Наблюдается умеренная активность КФ, подавляемая ионами тартрата. Дифференциальный диагноз М5а нужно проводить с ОМЛ МО, ОМЛ Ml.

При ОМоЛ с созреванием (М5в) содержание бластных клеток колеблется от 20 до 80%, остальные клетки представлены промо-ноцитами, моноцитами и гранулоцитами. Моноцитарные клетки при ОМоЛ с созреванием отличаются полиморфизмом. Властные клетки — крупного размера, с бобовидными, иногда расщепленными, лопастными, вдавленными ядрами, содержащими несколько нуклеол. Структура ядерного хроматина нежносетчатая; цитоплазма умеренная, со скудной пылевидной азурофильной зернистостью. Как и при ОМоЛ без созревания, при этом варианте лейкоза монобласты содержат большое количество подавляемой фторидом натрия неспецифической эстеразы (Яворковский Л. И., 1987) и КНЭ. Липиды и пероксидаза содержатся в части бластов в небольших количествах. В сыворотке и моче, как и при ОМоЛ без созревания, определяется большое количество фермента лизоци-ма. Бласты при ОМоЛ экспрессируют CD13, CD15, CD33, CD11, CD4, CD7 и моноцитарные CD 14. При М5а может выявляться CD34 — антиген ранних клеток-предшественников. Установлены цитогенетические аберрации — транслокации t(9;ll); t(10;ll); t(ll;17), связанные с Ilq23.

Нужно еще раз отметить, что в отличие от монобластных лейкозов при Ml, М2, МЗ и М7 вариантах ОМЛ, с которыми нужно проводить дифференциальный диагноз, позитивная реакция на аН АЭ обусловлена экспрессией общих или немоноцитарных эсте-раз (Хейхо Ф. Г. Дж, Кваглино Д., 1983). Реакция в этих случаях резистентна к ингибиции, но эта резистентность тоже может быть очень вариабельной. Диагностическое значение имеет высокая активность кислой фосфатазы в монобластах при ОМоЛ, которая ингибируется ионами татрата в отличие от других, не моноцитар-ных клеток (Яворковский Л. И., 1987; Глузман Д. Ф. и др., 2000).

Гранулоцитарная эстераза (ХАЭ) не свойственна моноцитар-ным клеткам. Гликоген выявляется в части бластов в виде бледно-розового диффузного или мелкогранулярного окрашивания. ОМЛ М5в необходимо дифференцировать с ОМЛ M3v и ОМЛ М4.

Острый эритромиелоз (Мб). При остром эритромиелозе число лейкемических эритрокариоцитов в костном мозге достигает 50% и более, а содержание бластных клеток составляет более 20% от числа неэритроидных клеток (классификация ВОЗ, 2000, 2002). При подсчете бластов эритробласты не учитываются (Wardi-man J. W. et al, 2002). Содержание бластов имеет решающее значение при дифференциальной диагностике с В,,-дефицитной и некоторыми другими гемолитическими анемиями, рефрактерной анемией с увеличением бластов, при которых содержание бластных клеток менее 20%. Властные клетки представлены эритробласта-ми, миелобластами, недифференцированными бластами. Эритро-идные клетки имеют признаки выраженной дисплазии, наблюдаются мегалобласты, макроциты, многоядерные эритрокариоциты, асинхронность в созревании ядра и цитоплазмы, дольчатость ядер. Могут наблюдаться явления эритрофагоцитоза лейкозными эрит-робластами. В миелобластах могут обнаруживаться палочки Ауэра. Признаки дисплазии отмечены в мегакариоцитах и нейтрофилах (гигантские уродливые ядра метамиелоцитов и палочко- и сегмен-тоядерных нейтрофилов). Наблюдается созревание эритрокариоцитов, и в пунктате можно видеть все стадии эритроидных клеток. Вообще картина костного мозга при этом варианте лейкоза очень вариабельна. Миелобласты I и II типов демонстрируют положительные реакции на МП, липиды, ХАЭ. Дополнительное диагностическое значение имеет позитивная PAS-реакция в эритрокарио-цитах. PAS-положительное вещество располагается в цитоплазме незрелых красных клеток в гранулярной форме, а в более зрелых „аритрокариоцитах — в диффузной форме. Реакция вариабельна и непостоянна. Это не абсолютно специфичный признак, так как известны случаи эритромиелоза, когда эритрокариоциты PAS-не-гативны. Нужно также учитывать, что PAS-позитивная реакция в ядросодержащих эритроидных клетках встречается при некоторых гемолитических анемиях. В эритрокариоцитах при остром эритромиелозе может быть обнаружена слабоположительная реакция на ссНАЭ, резистентная к ингибитору, КНЭ и КФ (Глузман Д. Ф. и др., 2000). Иммунологическими маркерами этого лейкоза являются CD 13, CD33, CD41, CD71 и гликофорин А. Имеют место хромосомные аберрации, относящиеся к 5 и 7 хромосомам (Воробьев А И. и др., 2002; Савченко В. Г., Паровичникова Е. Н., 2001, б; Савченко В. Г. и др., 2001, а).

Вариантом острого эритромиелоза является острый эритролей-коз (Мбв), при котором в костном мозге преобладают эритроблас-ты без признаков созревания (Глузман Д. Ф. и др., 2000; Френкель М. А, 2001). Лейкемические эритробласты содержат полисахариды в гранулярной форме и в виде блоков. Установить диагноз острого эритролейкоза помогает иммунофенотипирование, в результате которого выявляется экспрессия эритробластами специфического для них маркера — гликофорина А и В, а также CD36, CD71, CD33, CD117 (Глузман Д. Ф. и др., 2000; Френкель М. А, 2001). Дифференциальный диагноз проводится с О МЛ МО, М7 (мегакариоцитарный лейкоз).

Острый мегакариоцитарный лейкоз (М7) редкая форма острого лейкоза, которая характеризуется очень полиморфной картиной костного мозга. Морфоцитохимическая диагностика этого лейкоза затруднена. Властные клетки в количестве не менее 20% представлены недифференцированными бластами, миелобластами и микрогенерациями мегакариобластов. Последние почти таких же размеров, как лимфобласты или миелобласты. Ядра мегакариобластов характеризуются плотной структурой ядерного хроматина, неотчетливыми нуклеолами, узкой отростчатой базофильной цитоплазмой. Аспират из кости, как правило, беден вследствие мие-лофиброза и потому часто малоинформативен. В пунктате встречаются микрогенерации мегакариоцитов, свободные ядра мегака-риоцитов и их обломки. Иногда можно видеть мегакариоциты, отделяющие пластинки. Мегакариобласты не содержат липидов, МПО и ХАЭ. При электронной микроскопии в них выявляется тромбоцитарная нероксидаза. Они демонстрируют довольно высокую активность осНАЭ, КНЭ и умеренную активность аНБЭ, несколько чувствительных к ингибитору — фториду натрия (Лугов-ская С. А. и др., 1999). Полисахариды располагаются в них в виде скоплений у края мембраны на фоне диффузно окрашенной в розовый цвет цитоплазмы. Важно исследование периферической крови, где выявляются фрагменты мегакариоцитов и иногда наблюдается гипертромбоцитоз. Нужно проводить дифференциальную диагностику с МО, Ml, M5a и острым лимфобластным лейкозом, которая возможна только по результатам иммунофенотипирова-ния, выявляющего характерные для М7 маркеры: CD41, CD42 и/ или CD61, CD36. Не менее 50% клеток должны иметь иммунофенотип мегакариоцитов (Логинский В. Е. и др., 1996; Глузман Д. Ф. и др., 2000). В 5% случаев находят цитогенетические нарушения, наиболее частыми из которых являются моносомия 7 или трисо-мия 8, 10 и 21. Таким образом, из острых миелобластных лейкозов острый недифференцируемый лейкоз, эритролейкоз и острый ме-гакариоцитарный лейкоз прежде всего нуждаются в обязательном иммунофенотипировании для установления антигенного профиля их бластных клеток.

Острый плазмобластный лейкоз — очень редкая форма острого лейкоза. Одни авторы считают, что он является лейкозом de novo, следствием пролиферации и экстрамедуллярного распространения незрелых плазматических клеток (Воробьев А. И. и др., 2002; Mufti G. J. et al.,1996). По мнению других авторов, это может быть проявлением множественной миеломы, ее бластной трансформацией (Dimopoulos M. A, Palumbo A.,1994). Плазмобластный лейкоз характеризуется анемией и нейтропенией. Костный мозг инфильтрирован плазмобластами и более зрелыми клетками этого ряда. Маленькие плазматические клетки могут циркулировать в крови в большом количестве, в отличие от множественной миеломы. Плазмоциты имеют выраженную базофилию цитоплазмы, сгущающуюся к краю мембраны, и перинуклеарную зону. В цитоплазме могут встречаться азурофильные включения, подобные тельцам Ауэра. В некоторых случаях плазмобласты могут достигать больших размеров и напоминать бластные клетки при некоторых миелобластных лейкозах или крупные бласты злокачественной лимфомы (Mufti G. J. et al, 1996). Цитохимически в плазмоблас-тах выявляется высокая активность кислой фосфатазы и р-глюку-ронидазы в виде гранул (Глузман Д. Ф., 1978; Хейхо Ф. Г. Дж, Кваглино Д. К, 1983). Плазмобласты продуцируют патологические иммуноглобулины. Рекомендовано обязательное иммунофе-нотипирование для выявления обычных антигенов В-клеточной лимфоидной дифференцировки и поздних В-клеточных антигенов, например CD38 (Mufti G. J.,1996).

Под нашим наблюдением находилось двое больных с плазмо-бластным лейкозом. В обоих случаях имело место тотальное замещение костного мозга плазмоцитами различной степени зрелости — от плазмобластов до зрелых плазматических клеток. Плазматические клетки циркулировали в периферической крови, наблюдалась спленомегалия. При проведении цитохимических реакций у обоих больных в большинстве клеток определялась высокая активность кислой фосфатазы. В части клеток была выявлена аНАЭ и слабая диффузная реакция на полисахариды.

Острые лимфобластные лейкозы (ОЛЛ). Внедрение метода иммунофенотипирования позволило разделить ОЛЛ на Т- и IB-клеточные типы, включающие иодварианты, соответствующие различным уровням дифференцировки лимфоидных клеток. Возрастные, клинические, прогностические особенности ОЛЛ также показали, что лимфобластные лейкозы представляют собою весьма гетерогенную группу заболеваний. Авторы последних классификаций лейкозов (классификация ВОЗ, 2000, 2002) сочли нецелесообразным сохранение терминологии ФАБ-классификации для ОЛЛ (LI, L2, L3) в связи с тем, что диагностические и прогностические критерии морфологических вариантов L1 и L2 недостаточны, их корреляции с иммунофенотипом и генетическими маркерами чаще всего не наблюдается, а форма L3 ОЛЛ является эквивалентом лимфомы Беркитта в фазе лейкемизации. Классификация ВОЗ включает вместо лимфобластного лейкоза В-лимфобластный лейкоз/лимфому и Т-лимфобластный лейкоз/лимфому. В то же время А. И. Воробьев с соавторами (2002) сочли необходимым выделять ранее описанные основные формы В- и Т-лимфобластных острых лейкозов у детей и взрослых.

Морфологические особенности лейкозных лимфобластов варьируют в широких пределах. Микрогенерации лимфобластов (7-10 мкм) характеризуются очень узкой цитоплазмой, плотным ядерным хроматином, слаборазличимыми единичными нуклео-лами. Существуют варианты ОЛЛ, отличающиеся более гетерогенным составом бластной популяции, включающей как мелкие, так и средние и крупные бластные клетки с ядрами различных очертаний, более тонкой структурой ядерного хроматина и четкими одним-двумя ядрышками. Их цитоплазма достаточно выражена, и в таких случаях необходима дифференциальная диагностика с ОМЛ — Ml, МО, Мбв. М7. Бластные клетки при беркитто-подобном ОЛЛ/лимфоме Беркитта характеризуются средними и большими размерами, резко базофильной вакуолизированной цитоплазмой. В настоящее время главным критерием в классификации ОЛЛ являются не морфоцитохимические характеристики бластов, а их иммунофенотипическая характеристика и выявление линейных (Т- или В-клетки) или стадиеснецифических маркеров. Кроме того, для диагностики имеет значение выявле?ше различных патогенетических аномалий в лимфобластах. В то же время в ряде случаев морфоцитохимические особенности лимфобластов могут быть дополнительным критерием в дифференциальной диагностике как между Т- или В-клеточными вариантами ОЛЛ, так и между ОЛЛ и некоторыми формами нелимфобластных лейкозов. Литературные данные (Глузман Д. Ф. и др., 1975: Глузман Д. Ф. и др., 1987; Глузман Д. Ф. и др., 2000) и наш опыт показали, что Т- и В-лимфобласты имеют морфоцитохими-ческпе особенности. В-лимфобласты отличаются большим полиморфизмом, в то время как Т-лимфобласты — небольшие клетки с высоким ядерноцитоплазматическим соотношением. Признаком В-лимфобластов является наличие в них, в большинстве случаев, полисахаридов. В миело- и монобластах реакция имеет слабый диффузный или мелкогранулярный характер, причем гранулы располагаются беспорядочно на фоне диффузно окрашенной цитоплазмы. В В-лимфобластах средние и крупные темно-малиновые гранулы гликогена располагаются в виде венчика на фоне неокрашенной цитоплазмы, иногда сливаясь в блоки. Могут выявляться лишь 1-2 крупные гранулы в небольшом количестве клеток, иногда располагаясь над ядром клетки. В Т-лимфоблас-тах полисахариды чаще всего не выявляются или имеют характер скудной мелкой зернистости в части клеток. В то же время в Т-лим-фобластах обнаруживается высокая активность кислой фосфата-зы, ос-нафтилацетат-эстеразы и КНЭ. Кислая фосфатаза может располагаться в цитоплазме этих клеток в виде крупных гранул или фокусно — в виде пятна. Такой характер распределения фермента, а также отсутствие или слабая реакция на полисахариды типичны для Т-клеточного ОЛЛ, хотя нужно учитывать, что подобный характер реакции наблюдается иногда в эритро-, моно- и мегакариобластах. осНАЭ располагается в Т-лимфобластах локально, в виде 1-2 небольших, интенсивно окрашенных пятнышек. Реакция не чувствительна к фториду натрия. Активность КФ, аНАЭ и КНЭ в В-лимфобластах чаще всего не определяется или слабо выражена.

Для подтверждения диагноза ОЛЛ имеет значение не только выявление полисахаридов или кислой фосфатазы, но и отрицательные реакции на маркерные для миелоидных клеток миелопер-оксидазу, липиды и хлорацетат-эстеразу.

Диагностика редких вариантов бифенотипичных, гибридных (бласты несут одновременно антигены двух различных клеточных линий) или стволовоклеточных лейкозов (клетки экспрессируют в основном антигены ранних предшественников гемопоэза) целиком основана на иммунофенотипировании.

Хронический миелолейкоз (ХМЛ). Роль цитохимических исследований при хронических лейкозах не столь велика, как при ОНЛЛ, однако нужно отметить важность реакции на щелочную фосфатазу (ЩФ) в зрелых нейтрофилах при ХМЛ. Щелочная фосфатаза является маркером этой формы лейкоза. При ХМЛ в развернутой фазе заболевания активность ЩФ в нейтрофилах резко снижена или может вообще отсутствовать. Дефицит ЩФ в нейтрофилах ассоциирован с хромосомными нарушениями при ХМЛ и является скорее всего результатом транслокации t(9;22) и существования химерного гена BCR-ABL.

Властный криз ХМЛ характеризуется повышением активности ЩФ и иногда ее полной нормализацией. Определение активности ЩФ имеет значение при дифференциальной диагностике ХМЛ с миелофиброзом, полицитемией и лейкемоидными реакциями, при которых активность ЩФ нормальна или даже повышена. Использование цитохимических реакций на МП, фосфолипиды и полисахариды способствует идентификации БК ХМЛ миелоидного или лимфоидного типа.

Волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ). При ВКЛ более чем в 90% случаев клетки имеют иммунофенотип зрелых В-лимфоци-тов. Они экспрессируют пан-В-клеточные антигены CD19, CD20, CD22. Кроме обычного варианта ВКЛ описывают лейкемический тип этого заболевания, при котором, как считают, лейкемические клетки менее зрелые. Особенностью ВКЛ является присутствие в костном мозге и периферической крови специфических лейкеми-ческих клеток, морфология которых послужила основанием для появления названия этого лейкоза. Это мононуклеары, цитоплазма которых имеет отростчатые, ворсинчатые очертания. Ядра клеток круглые, овальные, лопастные, имеют нежносетчатую структуру хроматина и слабо контурируемые 1-2 нуклеолы. Цитоплазма голубого или серо-голубого цвета. Для диагностики ВКЛ имеет значение выявление активности тартрат-резистентной кислой фос-фатазы, которая обнаруживается у 95% больных (Луговская С. А. и др., 1999), и НЭ. Одно-, двух- или трехростковая цитопения, нейтропения и моноцитопения, а также спленомегалия очень характерны для ВКЛ (Волкова М. А, 2001).

Таким образом, вопреки мнению некоторых авторов, предлагающих отказаться от морфоцитохимического анализа клеток при диагностике лейкозов (Бене М. К. и др., 1996), в настоящее время’ общепризнано, что первоначальная диагностика большинства ОНЛЛ основана на результатах морфоцитохимических исследований, которые являются в этих случаях достаточно информативными и доступными методами. В то же время для диагностики таких вариантов штелобластных лейкозов, как ОМЛ Ml, ОМЛ МО, ОМЛ Мбв, ОМЛ М7, для дифференциальной диагностики между М2 и M3v, М5в и M3v вариантами ОМЛ, а также для всех лимфобластных лейкозов необходимо проводить иммунофеноти-пирование и цитогенетические исследования.



Источник: vuzlit.ru


Добавить комментарий