Стероиды и биохимический анализ крови

Стероиды и биохимический анализ крови

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 3 Строение, свойства, биологическая роль простых липидов

тверже. Состав и качество жира характеризуются особыми параметрами, называемыми химическими константами триглицеридов:

1) йодное число – это количество граммов йода, которое связывается 100 граммами жира. Поскольку йод связывается только с двойными связями жирных кислот, йодное число характеризует степень ненасыщенности жира.

2)кислотное число – количество милиграммов гидрооксида калия, необходимое для нейтрализации 1 грамма жира. Указывает на количество свободных жирных кислот в жире.

3)число омыления количество милиграммов гидрооксида калия, необходимое для нейтрализации всех жирных кислот, свободных и связанных, входящих в состав жира.

Стероиды – это группа соединений, имеющих в своей структуре ядро, образованное гидрированным фенантреном (кольца А, В, С) и циклопентаном (кольцо D). Каждое из 6-углеродных колец может находиться в форме «кресла» или «ванны», что является более устойчивой конформацией. В свою очередь, по отношению друг к другу кольца могут находиться в цис- или транс-положениях.

Среди стероидов выделяется группа соединений, получивших название стеринов (стеролов). Характерным для них является наличие гидроксильной группы в положении 3, а также боковой цепи в положении 17:

C D

Стерины подразделяют на зоо-,фито- и микостерины (содержатся в грибах). У важнейшего представителя стеринов – холестерина – все кольца находятся в транс-положении и, кроме того, он имеет двойную связь между 5-

м и 6-м углеродными атомами.

Холестерин, следовательно, является ненасыщенным спиртом. Боковые прверхности стероидного ядра были бы почти плоскими, если бы не метильные группы, присоединенные к С10 и С13, что делает одну из сторон молекулы более выпуклой. Эта сторона обозначается как β, а противоположная ей как α. Прородный холестерин содержит гидроксильную группу на β- поверхности. Его изомер с гидроксильной группой на α-поверхности называется эпихолестерин.

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-30-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 3 Строение, свойства, биологическая роль простых липидов

Кольцевая структура холестерина отличается значительной жесткостью, а боковая цепь, напротив, относительно подвижна. В чистом виде холестерин представляет собой кристаллические жемчужные пластинки или иглы, воскообразные на ощупь и не растворимые в воде, но растворимые в органических соединениях. Наличие у холестерина в 3-м положении гидроксильной группы обусловливает ряд физико-химических свойств. Благодаря этой группе холестерин образует эфиры с жирными кислотами. Эфиры холестерина, так же как и сами жирные кислоты, в зависимости от температуры и других условий, могут находиться в состоянии жидких кристаллов, в том числе и в организме животных и человека.

Холестерин является одним из важнейших веществ организма. Каждая клетка содержит его. Неэстерифициованный холестерин вместе с фосфолипидами и белками обеспечивает избирательную проницаемость клеточной мембраны и влияет на состояние мембраны и на активность связанных с ней ферментов. В цитоплазме клеток холестерин находится преимущественно в виде эфиров с жирными кислотами, образуя мелкие капли.

В теле взрослого человека общее содержание холестерина оценивается величиной порядка 200-350 граммов. В крови большая часть холестерина связана с белками. Норма содержания общего холестерина 1,5 – 2,5 г/л. У взрослого человека примерно 67-70 % холестерина плазмы крови находится в составе липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), 9-10 % в составе липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) и 20-24 % в составе липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). У животных, не склонных к возникновению атеросклероза большая часть холестерина находится в плазме виде ЛПВП, обладающих антиатерогенным действием.

Гипохолестеринемия может быть связана с пониженным поступлением холестерина с пищей или понижением биосинтеза эндогенного холестерина, что в свою очередь может быть связано либо с недостатком питания, либо с блокадой биосинтеза холестерина в печени. Гиперхолестеринемия может быть обусловлена повышением скорости биосинтеза холестерина или повышением его поступлением с пищей. Также гиперхолестеринемия может быть вызвана наследственным недостатком рецепторов к ЛПНП, вследствие чего резко снижается захват и последующий катаболизм холестерина. Гиперхолестеринемия лежит в основе развития атеросклероза.

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-31-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 3 Строение, свойства, биологическая роль простых липидов

В мембранах растительных клеток содержатся близкие к холестерину соединения, называемые фитостеринами. Они отличаются от холестерина строением только боковой цепи. В дрожжевых клетках находится эргостерин, который отличается строением боковой цепи и тем, что содержит двойную связь между 7-м и 8-м атомами углерода в кольце. Клетки бактерий стеринов не содержат.

Стигмастерин

Ситостерин

Эргостерин

Восстановленное производное холестерина – копростерин, содержится в составе фекалий человека и млекопитающих.

Желчныекислоты

Из холестерина в печени образуются желчные кислоты. По химическому строению эти соединения близки к холестерину. Для них характерно наличие укороченной разветвленной боковой цепи с карбоксильной группой на конце. Двойная связь в кольце В отсутствует, а кольца А и В сочленены в цис-положении. Стероидный кор в положениях 3, 7 и 12 содержит от одной до трех β-гидроксильных групп.

Желчные кислоты обеспечивают растворимость холестерина в желчи и способствуют перевариванию липидов. В печени вначале образуются первичные желчные кислоты − холевая и хенодезоксихолевая (антроподезоксихолевая).

 

O

 

O

 

 

 

OH

 

OH

OH

 

 

 

 

 

Холевая кислота Литохолевая кислота

Дегидроксилирование этих соединений по С-7 микрофлорой кишечника приводит к образованию вторичных желчных кислот − литохолевой и дезоксихолевой.

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-32-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 3 Строение, свойства, биологическая роль простых липидов

В организме человека присутствуют шесть стероидных гормонов: прогестерон, кортизол, альдостерон, тестостерон, эстрадиол и кальцитриол (устаревшее название – кальциферол).

За исключением кальцитриола, эти соединения имеют очень короткую боковую цепь из двух углеродных атомов или не имеют ее вовсе. Для большинства соединений этой группы характерно наличие оксогруппы при С-3 и сопряженной двойной связи С-4/С-5 в кольце А. Различия наблюдаются в строении колец С и D. В эстрадиоле кольцо А ароматическое и, следовательно, гидроксильная группа oблaдаeт свойствами фенольной ОН-группы. Кальцитриол отличается от гормонов позвоночных, однако также построен на основе холестерина. За счет светозависимой реакции раскрытия кольца В кальцитриол образует так называемый секостероид − стероид с раскрытым кольцом.

Экдизон − стероидный гормон насекомых − представляет собой более раннюю в эволюционном отношении форму стероидов. Стероидные гормоны, выполняющие сигнальную функцию, встречаются также в растениях.

Лекция4 Строение, свойства, биологическаярольсложныхлипидов

Глицерофосфолипиды в качестве структурной основы содержат трехатомный спирт глицерол. При гидролизе глицерофосфолипидов кроме глицерола обнаруживают две жирные кислоты, фосфорную кислоту и различные заместители. Жирные кислоты присоединяются к первому и второму атомам глицерола сложно-эфирной связью; при этом, как правило, природные глицерофосфолипиды содержат насыщенную жирную кислоту в первом положении, а ненасыщенную (моноеновую или полиеновую) – во втором. В третьей позиции находится остаток фосфорной кислоты, к которой присоединяются различные заместители. Если в третьем положении имеется только фосфорная кислота, глицерофосфолипид называется фосфатидной кислотой. Фосфатидная кислота образуется в организме в процессе биосинтеза триацилглицеролов и глицерофосфолипидов как общий промежуточной метаболит. Остаток фосфатидной кислоты называют фосфатидил; он входит в на-

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-33-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 4 Строение, свойства, биологическая роль сложных липидов

звание других глицефосфолипидов, после которого указывают название заместителя атома водорода в фосфорной кислоте.

Фосфатидная кислота

В качестве заместителя в природных глицерофосфолипидах находится либо аминоспирт холин, либо азотистое основание этаноламин, либо остаток аминокислоты серина, либо шестиатомный спирт инозитол, либо вторая молекула глицерола. В полном названии глицерофосфолипида будет учитываться название заместителя, которое присоединяется к слову «фосфатидил».

Фосфатидилхолин (лецитин) в своем составе содержит аминоспирт холин. Фосфатидилхолины широко распространены в клетках; особенно их много в мозговой ткани человека и животных, в растениях они встречаются в соевых бобах, зародышах пшеницы, семенах подсолнечника. В бактериальных клетках их содержание невелико.

Фосфатидилхолин

Фосфатидилэтаноламин (кефалин) содержит этаноламин, который присоединяется к остатку фосфорной кислоты эфирной связью:

Фосфатидилэтаноламин

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-34-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 4 Строение, свойства, биологическая роль сложных липидов

Фосфатидилэтаноламины (так же как и фосфатидилхолины) являются главными липидными компонентами, формирующими билипидный матрикс биологических мембран. При этом, как правило, фосфатидилхолины почти полностью располагаются во внешнем монослое билипидного матрикса, а фосфатидилэтаноламин – во внутреннем.

Фосфатидилсерин содержит полярную группу в виде остатка аминокислоты серина:

Фосфатидилсерин

Значение фосфатидилсерина определяется тем, что он является предшественником синтеза фосфатидилхолинов и фосфатидилэтаноламинов и в значительно меньших количествах входит в состав биологических мембран.

Фосфатидилинозитолы отличаются от других групп глицерофосфолипидов тем, что в их состав вместо азотсодержащих веществ входит шестиатомный циклический спирт инозитол. Они присутствуют в клеточных мембранах животных, высших растений, микроорганизмов; особенно высоко их содержание в миелиновых оболочках нервных волокон.

Фосфатидилинозитол

Важную биологическую роль фосфатидилинозитолы выполняют в виде фосфорилированных производных, например таких, как инозитол-4,5- дифосфат, моноинозитол-1,4,5-трифосфат, участвуя как вторичные мессенжеры (посредники) в реализации Са2+-зависимых действий ряда гормонов.

Фосфатидилглицеролы в качестве заместителя содержат ещё одну молекулу глицерола, которая, как и другие заместители, присоединяется к фосфатидилу эфирной связью:

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-35-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 4 Строение, свойства, биологическая роль сложных липидов

Фосфатидилглицерол

Фосфатидилглицеролы в значительных количествах обнаруживаются в бактериальных мембранах, а также в хлоропластах растений.

Кардиолипины можно рассматривать как производное фосфатидилглицеролов. у которых 3-гидроксигруппа второго остатка молекулы глицерола этерифицирована молекулой фосфатидной кислоты.

Кардиолипин (дифосфатидилглицерол)

Своим названием кардиолипин обязан сердечной мышце, из которой он был выделен впервые. Его содержание в плазматических мембранах клеток невелико, и в этом смысле кардиолипин относится к минорной фракции глицерофосфолипидов. Однако маркерным липидом он является для таких внутриклеточных органоидов, как митохондрии, в которых ему отведена исключительная роль в структурной организации и функционировании дыхательной цепи.

Плазмалогены − глицерофосфолипиды, у которых вместо остатка жирной кислоты при первом атоме углерода трехатомного спирта глицерола находится α- или β-ненасыщенный спирт, образующий простую эфирную связь с гидроксильной группой глицерола. При гидролизе этой эфирной связи образуется альдегид соответствующего спирта − фосфатидаль.

Плазмалогены бывают трех видов: фосфатидальэтаноламины, фосфатидальхолины и фосфатидальсерины. На долю плазмалогенов приходится около 10% фосфолипидов мозга и мышечной ткани. В тканях некоторых безпозвоночных их доля доходит до 25%, они обнаружены в эритроцитах, бактериальных мембранах и практически отсутствуют в растениях.

Общим свойством глицерофосфолипидов, объясняющим их важную роль в формировании билипидного матрикса как основы биологических мембран, играет амфипатичность их молекул, или, другими словами, наличие в их структуре гидрофобной и гидрофильной частей. Гидрофобная состав-

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-36-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 4 Строение, свойства, биологическая роль сложных липидов

ляющая представлена алифатическими радикалами жирных кислот, которые ориентированы внутрь билипидного матрикса, формируя гидрофобную полость. Гидрофильная составляющая представлена остатком фосфорной кислоты и различными полярными группами,которые ориентированы в водную фазу. Наличие асимметрического атома углерода в молекуле создает условия для существования изомеров. Все природные глицерофосфолипиды относятся к L-ряду.

Глицерофосфолипиды существуют не только в диацильной форме. Под действием фосфолипазы А2 они теряют остаток жирной кислоты у второго атома углерода глицерола с образованием лизофосфолипида, при этом меняются их свойства. Так, например, накопление лизофосфатидилхолина в мембране эритроцитов вызывает их разрушение, поскольку лизофосфатидилхолин приобретает свойства детергента.

Сфинголипиды являются производными 18-атомного, ненасышенного дигидроксиаминоспирта – сфингозина или его насыщенного аналога – дигидросфингозина.

Сфингозин

Сфингозин ацетилируется различными ЖК, образуя семейство молекул, называемых церамидами. Они отличаются радикалами жирных кислот. Обычно это жирные кислоты от 18 до 26 атомов углерода. Жирная кислота связана со сфингозином через аминогруппу с образованием амидной связи.

Церамид

Гидроксильные группы сфингозина способны взаимодействовать с другими радикалами.

Сфинголипидом, наиболее распространенным в природе, является сфингомиелин, фосфохолиновое производное церамида. Сфингомиелины имеют амфипатические свойства, сформированные, с одной стороны, радикалом жирной кислоты и алифатической частью самого сфингозина, а с другой – полярной областью фосфохолина. Сфингомиелины находятся в мем-

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-37-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 4 Строение, свойства, биологическая роль сложных липидов

бранах животных и растительных клеток. Особенно ими богата нервная ткань; кроме того их можно выделить из ткани почек, печени, крови.

Сфингомиелины содержат преимущественно насыщенные и моноеновые жирные кислоты, имеющие 18-24 атомов углерода. В состав жирных кислот входит значительное количество лигноцериновой и нервоновой кислот.

Сфингомиелин

Гликолипиды – ещё одна большая и разнообразная группа сложных липидов, основу которых составляют церамиды, где водород их гидроксильной группы замещен на разные углеводные фрагменты. Если углевод представлен моносахаридом (чаще галактозой), образуется моногексозилцерамиды, часто называемые цереброзидами. Цереброзиды содержатся в тканях животных, растений и микроорганизмах.

Галактозилцерамиды является основными гликолипидами мозговой и нервной тканей, содержат различные жирные кислоты, в том числе цереброновую (С24:1, гидроксикислота).

Церамид β-галактоза

Галактоцереброзид

Гидроксил у третьего углеродного атома моносахарида может взаимодействовать с серной кислотой, или, другими словами, сульфатироваться. В этом случае образуется сульфатид, обладаюший свойствами кислот и поэтому называется кислым сфинголипидом. При физиологическом значении рН сульфатиды имеют отрицательный заряд. Почти 25% цереброзидов мозга находятся в сульфатированном состоянии. В других тканях содержатся, главным образом, глюкозилцерамиды.

Наиболее сложные по составу липиды – это ганглиозиды, к которым относятся более 60 видов. В их состав входят сфингозин, жирная кислота, несколько углеводов и, что особенно характерно, один или несколько остатков сиаловой кислоты.

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-38-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 4 Строение, свойства, биологическая роль сложных липидов

Сиаловыми кислотами называют N-ацетильные производные нейраминовой кислоты, которая представляет собой продукт конденсации маннозамина и пировиноградной кислоты.

Сиаловая (N-ацетилнейраминовая) кислота

В свободном виде сиаловые кислоты обнаружены в спинномозговой жидкости, слизистой оболочке желудка, щитовидной железе человека, икре некоторых видов рыб. Наиболее важную биологическую роль выполняют, входя в состав биополимеров животных клеток (гликолипиды, гликопротеины, олигосахариды молока и т.п.).

Доминирующей сиаловой кислотой, наиболее часто встречающейся в ганглиозидах, является N-ацетилнейраминовая кислота (NeuNAc, NANA). Благодаря наличию карбоксильной группы в остатке N-ацетилнейраминовой кислоты все ганглиозиды являются кислыми соединениями. Углеводы представлены гексозами (D-глюкоза и D-галактоза) и гексозаминами (N- ацетилглюкозамин, чаще N-ацетилгалактозамин). Ганглиозиды могут содержать от двух до десяти и более углеводных остатков.

Ганглиозиды в больших количествах находятся в нервной ткани. В сером веществе мозга ганглиозиды составляют около 6% мембранных липидов. Их выделяют из плазматических мембран эритроцитов, гепатоцитов, клеток селезенки и других тканей и органов.

Все ганглиозиды построены на основе моносиалоганглиозида Gm1, олигосахаридная цепь которогосодержит один остаток NANA.

Ганглиозид Gm1

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-39-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 4 Строение, свойства, биологическая роль сложных липидов

Согласно номенклатуре ганглиозиды обозначаются буквой G, например Gm1. Буквами М, D, T и Q обозначают количество остатков сиаловой кислоты (моно-, ди, три- и т.д.). Цифра обозначает специфическую последовательность углеводов в ганглиозидах.

Ганглиозиды – специфические детерминанты межклеточного взаимодействия, т.к. они играют важную роль в росте и дифференцировке тканей. Их углеводные «головки» выступают над поверхностью клетки и служат специфическими рецепторами ряда пептидных гормонов и некоторых бактериальных токсинов. Ганглиозидов обладают высокой тканевой специфичностью и выступают в роли антигенов клеточной поверхности.

Лекция5 Аминокислотныйсоставбелков

Белкииихфункции

Белки это высокомолекулярные азотсодержащие соединения, состоящие из аминокислот, соединенных пептидной связью (-CО-NН-). Белки называют также протеинами (от гр. protos первый, важнейший).

Каждый белок характеризуется специфической аминокислотной последовательностью и индивидуальной пространственной структурой (конформацией). На долю белков приходится не менее 50% сухой массы органических соединений животной клетки. В организме человека насчитывается до 5 млн. различных видов белков. Белковая молекула может состоять из одной или нескольких цепей, содержащих от пятидесяти до нескольких сотен (иногда более тысячи) аминокислотных остатков. Молекулы, содержащие менее пятидесяти аминокислотных остатков, называют пептидами. В нативном состоянии белковые макромолекулы обладают специфической конформацией. Характерная для данного белка конформация определяется последовательностью аминокислотных остатков и стабилизируется водородными связями между пептидными и боковыми группами аминокислотных остатков, а также электростатическими и гидрофобными взаимодействиями.

В настоящее время широкое развитие при изучении структуры и функ-

ции белков получили структурная геномика, протеомика и биоинформати-

ка. Геномика – комплексная наука, изучающая геномы живых организмов. Структурная геномика исследует содержание и организацию геномной информации. Протеомика как наука сформировалась на основе структурной геномики. Термин «протеомика» происходит от двух слов PROTEins (белки) и genOME (геном). Слово «протеин» является производным от греческого «proteios» – первоначальный. Это подчеркивает ключевую роль белков в реализации всех жизненных процессов, происходящих в биосфере. Протеомику можно определить как отрасль биологической науки, изучающую экспрессированные геномом белки: их состав, структуру, функциональные свойства,

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-40-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 5 Аминокислотный состав белков

механизмы регуляции активности, взаимодействия белков. Если целью геномики является инвентаризация генов, т. е. информационного материала клетки, то одной из основных целей современной протеомики является инвентаризация протеома – совокупности белков организма. В научной печати упоминание о протеоме впервые появилось в 1995 г. Следовательно, протеомика как наука сформировалась позже геномики и на ее основе.

Важное место в изучении структуры белков занимает биоинформатика. Биоинформатика – наука, занимающаяся изучением биологической информации с помощью математических, статистических и компьютерных методов. Биоинформатика как наука появилась на стыке молекулярной биологии, генетики, математики и компьютерных технологий. Ее основная задача – разработка вычислительных алгоритмов для анализа и систематизации данных о структуре и функциях нуклеиновых кислот и белков. Биоинформатика позволяет с помощью специальных компьютерных программ анализировать и обобщать научные результаты, полученные при исследовании протеома, предсказывать функции генов и зашифрованных в них белков, строить модели межбелкового взаимодействия, осуществлять дизайн белковых молекул.

Функциибелков

Ферментативная. Белки катализируют реакции обмена веществ (пищеварение, дыхание и др.), мышечного сокращения, нервной проводимости.

Строительная. Структурные белки составляют основу костной и соединительной тканей, шерсти, роговых образований, формируют остов клеточных органелл (митохондрий, мембран и др.).

Сократительная. При посредстве белков сократительной системы (актина и миозина) по единому механизму осуществляются расхождение хромосом при делении клетки, движение жгутиков, работа мышц животных и человека.

Регуляторная. Регуляторные белки контролируют биосинтез белка и нуклеиновых кислот. К регуляторным белкам относятся также пептиднобелковые гормоны, которые секретируются эндокринными железами.

Рецепторная. С помощью специальных рецепторных белков наружной поверхности плазматической мембраны клеткой воспринимаются информация о состоянии внешней среды, различные регуляторные сигналы.

Транспортная. Транспортные белки, или белки-переносчики, участвуют в активной транспортировке ионов, липидов, сахаров и аминокислот через биологические мембраны.

Защитная. Защитные белки, к которым относятся иммуноглобулины, формируют защитные системы высших организмов. К защитным белкам относятся белки комплемента, отвечающие за лизис чужеродных клеток и активацию иммунологической функции, белки системы свертывания крови (тромбин, фибрин) и противовирусный белок интерферон.

Специальная. При участии белков биоэнергетической системы (например, родопсин, цитохромы) происходят преобразование и утилизация энер-

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-41-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 5 Аминокислотный состав белков

гии, поступающей в организм с питанием, а также энергии солнечного излучения.

Питательная. Пищевые и запасные белки (казеин, проламины) играют важную роль в развитии и функционировании организмов.

Элементарныйсоставбелков

Каждый белок (или смесь функционально связанных белков) характеризуется отличным от других белков элементарным составом, однако все белки обязательно содержат пять элементов: азот, углерод, кислород, водород и серу. Их содержание в разных белках колеблется и составляет: углеро-

да – 51-55%; кислорода – 21,5-23,5%; водорода – 6-7%; азота – 15-17,6%; се-

ры – 0,3-2,5%. Обязательно присутствие углерода, водорода, кислорода и азота объясняется тем, что они входят в состав всех аминокислот. Большое отличие содержания серы в отдельных белках объясняется тем, что она входит в состав отдельных аминокислот (метионин, цистеин), содержание которых в разных белках различно.

Среднюю величину содержания азота в белках (16%) используют для расчета поступления белков с пищей и определения расхода белков организмом. Зная суммарное поступление азота с пищей или величину его выведения из организма в составе всех азотсодержащих конечных продуктов обмена, можно определить поступление или расход белка организмом. Для этого азот пищи или конечных продуктов обмена умножают на коэффициент 6,25 (100/16=6,35). Например, 15 г азота конечных продуктов обмена соответствует 93,75 г белка.

В состав некоторых белков входят фосфор, железо, медь, цинк, йод и некоторые другие элементы.

Методывыделенияиочисткибелков

Для подробного исследования физико-химических и биологических свойств белков, а также изучения их химического состава и структуры непременным условием является получение белков в химически чистом, гомогенном состоянии. Последовательность операций по выделению белков такова: измельчение биологического материала (гомогенизация), извлечение белков (перевод их в растворенное состояние экстракция), выделение иссле-

дуемого белка из смеси других (очистка и получение индивидуального белка).

Обычные методы органической химии, применяемые для выделения веществ из смеси (нагревание, перегонка, возгонка, кристаллизация и др.) для белков неприемлемы, т.к. белки чувствительны к повышению температуры и действию многих химических реагентов (органические растворители, кислоты, щелочи). При повышении температуры белки подвергаются денатурации (теряют нативные свойства, в частности, растворимость, биологическую активность), поэтому разработаны эффективные методы выделения белков в

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-42-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 5 Аминокислотный состав белков

«мягких» условиях при низкой температуре (не выше 4°С), с применением щадящих нативную структуру химических реагентов.

Все методы разделения смесей основаны на том, что разделяемые компоненты в результате каких-либо манипуляций оказываются в разных участках системы и могут быть механически отделены друг от друга.

Выделение индивидуальных белков является ступенчатым процессом, т.к. на первых этапах очистки фракции содержат множество примесей. На каждой ступени разделения должна получаться фракция, более богатая необходимым веществом, чем предыдущая. Такой процесс называют фракциони-

рованием.

На каждой стадии разделения белок должен находиться либо в виде раствора, либо в виде осадка.

Для осаждения с помощью дегидратации необходимо понизить рас-

творимость белка. Растворимость белка зависит от их способности к гидратации. У глобулярных водорастворимых белков высокий уровень гидратации обеспечивается расположением гидрофильных групп на поверхности. Добавление органических растворителей понижает степень гидратации и приводит к осаждению белка. В качестве таких растворителей используют ацетон. Осаждают белки также с помощью солей, например сульфата аммония. Этот метод основан на том, что при повышении концентрации соли в растворе происходит сжатие ионных атмосфер, образуемых противоионами белка, что способствует сближению их до критического расстояния, на котором межмолекулярные силы ван-дер-ваальсова притяжения перевешивают кулоновские силы отталкивания противоионов. Это приводит к слипанию белковых частиц и их выпадению в осадок.

При изоэлектрическом осаждении заряд белков обусловлен остатками аспаратата и глутамата (отрицательный заряд) и остатками лизина и аргинина (положительный заряд). По мере повышения рН различными способами заряд белков проходит от положительных к отрицательным значениям и в изоэлектрической точке оказывается равен нулю. В результате белок лишается своей ионной атмосферы и его частицы слипаются, выпадая в осадок.

При центрифугировании выпавший осадок белка можно выделить фильтрованием. Частицы осажденного вещества под действием центробежной силы оседают на дне центрифужных стаканов и сжимаются в плотный осадок, с которого оставшийся раствор (надосадочная жидкость, или супернатант) легко сливается или отсасывается. Скоростные центрифуги (ультрацентрифуги) создают центробежное ускорение порядка 105g (т.е. 105 ускорений свободного падения), что позволяет осаждать даже некоторые крупные надмолекулярные агрегаты рибосомы и вирусы.

Сорбция основана на различном сродстве компонентов смесей к определенным веществам сорбентам. Наиболее часто используемый сорбент гель фосфата кальция (гидроксиапатит), или активированный уголь. Эффективную сорбцию можно получить на ионитахсорбентах, имеющих на поверхности заряженные группы. В исходном состоянии эти заряды скомпенсированы какими-либо подвижными противоионами. Практически при сорб-

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-43-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 5 Аминокислотный состав белков

ции на ионитах происходит обмен этих противоионов. Если на поверхности сорбента находятся отрицательно заряженные группы, он связывает катионы

иего называют катионитом. Соответственно сорбент с положительно заряженными группами называют анионитом. В качестве ионитов (после соответствующей химической обработки) чаще всего используют материалы на гидрофильной основе: целлюлозе, декстране, силикагеле или пористых стеклах.

Молекулярные сита представляют собой материалы с очень маленькими порами определенного размера. Следует отметить отличие этих «сит»: крупные частицы не остаются на поверхности материала «сита», а обтекают его частички (гранулы), тогда как мелкие вещества примесей диффундируют в частицы сита и таким образом задерживаются. Материалом для молекулярных сит могут служить сефадекс (полисахарид декстран, у которого после соответствующей обработки цепи оказываются сшитыми трехуглеродными мостиками) или полиакриламид, линейные цепи которого сшиты метиленовыми мостиками.

При перечисленных методах в конечной смеси остаются вспомогательные низкомолекулярные вещества органические растворители, соли и кислоты. Для очищения от них используется метод диализа. Он основан на применении мембран, проницаемых для воды и низкомолекулярных веществ

инепроницаемых для белков. Чаще всего с этой целью используют пленки из целлофана (нитрат целлюлозы). В лаборатории подлежащий диализу раствор белка помещают в мешок из целлофана и погружают в сосуд с водой. Непрерывный ток воды через сосуд приводит к полному переходу в него всех проходящих через целлофан веществ, а белки остаются внутри.

Аминокислотныйсоставбелков

Структурным компонентом белковой молекулы является аминокисло-

та. Аминокислотами называются органические кислоты, содержащие одну или несколько аминогрупп. В зависимости от положения аминогруппы по отношению к карбоксилу различают α-, β- и γ-аминокислоты:

α-аминомасляная β-аминопропионовая γ-аминомасляная

Все аминокислоты, за исключением глицина, имеют хиральный (асимметричный) центр, вследствие чего обладают оптической активностью. Хиральный центр атом углерода аминокислоты (у протеиногенных аминокислот это α-углерод), при котором имеются 4 разных заместителя:

1.радикал аминокислоты (-R);

2.карбоксильная группа (-СООН);

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-44-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 5 Аминокислотный состав белков

3.аминогруппа (-NH2);

4.атом водорода (-Н).

Конфигурация при асимметрическом углероде с максимальным номером определяет принадлежность к D- (аминогруппа справа) или L- (аминогруппа слева) ряду подобно тому, как в пространстве располагаются заместители у глицеринового альдегида. Аминокислоты, имеющие асимметрию, сходную с D-глицеральдегидом, относят к D-аминокислотам, аминокислоты, имеющие асимметрию, сходную с L-глицеральдегидом – к L-аминокислотам.

H H

L-аминокислота D-аминокислота

D- и L-изомеры зеркальные изомеры соответствующей аминокислоты, называемые энантиомерами. Рацемическая смесь смесь энантиомеров в равных мольных долях, не обладающая оптической активностью. D- изомеры аминокислот сладкие, L-изомеры горькие или безвкусные. В составе белков млекопитающих имеются только L-изомеры. D-изомеры, наряду с L-изомерами, встречаются только у некоторых бактерий.

Химическиесвойствааминокислот

Поскольку аминокислоты имеют в своем составе как кислотную, так и основную группы, они способны реагировать и с кислотами, и с основаниями. Аминокислоты являются амфотерными органическими соединениями. В определенных условиях (например, при воздействии определенных ферментов) аминокислоты способны реагировать друг с другом. Связь, которой соединены остатки аминокислот, называется пептидной, а соединение, состоящее из двух остатков аминокислот, – дипептидом. Трипептиды, тетрапептиды и т.д. – полипептиды.

 

R1

R2

NH

 

CH C

 

NH

 

 

CH C OH

 

 

2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

O

 

O

Дипептид

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-45-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 5 Аминокислотный состав белков

Как уже отмечалось, аминокислоты являются амфотерными соединениями, т.к. как содержат и кислотный (-COOH), и основной (-NH2) центры. Следовательно, в нейтральной и близкой к ней среде они существуют в виде внутренних солей (биполярных ионов, или цвиттер-ионов).

R — CH — COO

NH3+

Кроме того, некоторые аминокислоты содержат в радикале дополнительные функциональные группы, способные к ионизации.

Основные аминокислоты в водном растворе дают щелочную реакцию и несут положительный заряд:

 

 

 

 

O

 

 

 

O

+ OH

 

CH2 — (CH2)3

— CH — C

+ HOH

 

CH2

— (CH2)3

— CH — C

 

 

 

 

 

 

 

 

O

 

 

 

O

 

NH2

+NH3

 

+NH3

 

+NH3

 

Кислые аминокислоты в водном растворе проявляют кислотные свойства и обладают отрицательным зарядом:

H2O

HOOC — CH2 — CH — COO OOC — CH2 — CH — COO+ H+

На диссоциацию аминокислот оказывает влияние pH среды. В очень кислых растворах группа -NH2 протонирована полностью, а COOH-группа практически не ионизирована. В сильно щелочных растворах наоборот: при значениях pH от 4 до 9 каждая из диссоциирующих групп находится в равновесии со своей неионизированной формой, а обе группы вместе находятся в равновесии с биполярным ионом:

H3+N — CH — COOН

H+

H3+N — CH — COO

H+

H2N — CH — COO

+H+

+H+

 

 

 

R

 

R

 

R

Катионная форма

Биполярный ион (амфиион)

Анионная форма

сильно кислая среда

 

 

 

 

 

 

pH

 

 

 

 

 

сильно

щелочная

(рН < 5)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

среда (рН > 9)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Амфотерные свойства аминокислот проявляются и в их способности

образовывать соли, реагируя как с кислотами, так и с основаниями:

 

 

 

 

NaOH

 

 

R — CH — C

O

 

Натриевая соль

 

 

 

 

 

 

 

ONa

аминокислоты

 

 

 

 

Н2О

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

R — CH — COOH

 

HCl

 

 

 

NH2

 

 

+

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

NH2

 

 

R — CH — COOH

Хлорид

 

 

 

Cl

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

NH3

 

 

 

аминокислоты

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Еще одним проявлением амфотерности является способность амино-

кислот образовывать окрашенные растворимые комплексные соединения с

Cu2+:

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-46-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 5 Аминокислотный состав белков

O

R — CH — C

H2N O

Cu

O NH2

C — CH — R

O

Если сумма зарядов на аминокислоте равна нулю, то значение рН носит название изоэлектрической точки (pI).

При нагревании в сухом виде различные аминокислоты ведут себя по разному. Так, α-аминокислоты образуют циклические дипептиды дикетопиразины:

В отличие от них, β-аминокислоты претерпевают дезаминирование:

СН3-СН2-СН(NH2)-CH2-COOH → СН3-СН=СН-CH2-COOH + NH3

γ-аминокислоты превращаются в циклические внутримолекулярные пептиды лактамы:

Аминокислоты хорошо растворимы в воде, малорастворимы в органических растворителях; хорошо кристаллизуются; имеют высокую плотность и исключительно высокую температуру плавления. Эти свойства указывают на взаимодействие аминных и кислотных групп, вследствие чего аминокислоты в твёрдом состоянии и в растворе (в широком интервале рН) находятся в цвиттер-ионной форме. Взаимное влияние групп особенно ярко проявляется у α-аминокислот, где обе группы находятся в непосредственной близости.

Классификацияаминокислот, заменимыеинезаменимыеаминокислоты

Все аминокислоты отличаются характером радикала, который может быть ациклическим или циклическим. В состав радикала может дополнительно входить вторая карбоксильная группа (такие аминокислоты называются моноаминодикарбоновые) или две аминных группы (диаминомонокарбоновые). В составе отдельных аминокислот могут находиться гидроксильные (серин, треонин), сульфгидрильная (цистеин) и метильная (метионин) группы.

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-47-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 5 Аминокислотный состав белков

Большинство аминокислот, участвующих в обменных процессах и входящих в состав белков, могут поступать с пищей или синтезироваться в организме в процессе обмена (из других аминокислот, поступающих в избытке). Они называются заменимыми. Некоторые аминокислоты не могут синтезироваться в организме и должны поступать с пищей – это незаменимые аминокислоты. Таких аминокислот девять (гистидин, триптофан, фенилаланин,

лизин, метионин, треонин, изолейцин, лейцин, валин).

Практически все белки построены из двадцати α-аминокислот, принадлежащих (за исключением глицина) к L-ряду (табл.5.1).

 

Протеиногенные аминокислоты

 

Таблица 5.1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Название

Структура

3-х

3-х

1-букв. **

 

(R-CH(NH2)-COOH)

букв.

букв.

межд.

 

 

 

 

 

 

 

 

межд.

межд.

обозн.

 

 

 

 

 

 

 

 

обозн.

обозн.

 

 

Глицин

NH2-CH2-COOH

Гли

Gly

G

 

Аланин

CH3CH(NH2)-COOH

Ала

Ala

A

 

Валин

(CH3)2CH-CH(NH2)-COOH

Вал

Val

V

Н

Лейцин

CH3-CH(CH3)-CH2CH(NH2)-COOH

Лей

Leu

L

Н

Изолейцин

CH3-CH2-CH(CH3)-CH(NH2)-COOH

Иле

Ile

I

Н

Серин

HO-CH2CH(NH2)-COOH

Сер

Ser

S

 

Треонин

CH3-CH(OH)-CH(NH2)-COOH

Тре

Thr

Т

Н

Цистеин

HS-CH2CH(NH2)-COOH

Цис

Cys

С

 

Метионин

CH3-S-(CH2)2CH(NH2)-COOH

Мет

Met

М

Н

Лизин

NH2-(CH2)4CH(NH2)-COOH

Лиз

Lys

К

Н

Аргинин

NH2-C(=NH)-NH-(CH2)3CH(NH2)-COOH

Арг

Arg

R

ПЗ

Аспарагиновая

COOH-CH2CH(NH2)-COOH

Асп

Asp

D

 

к-та

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Аспарагин

NH2-C(=O)-CH2CH(NH2)-COOH

Асн

Asn

N

 

Глутаминовая

HOOC-(CH2)2CH(NH2)-COOH

Глу

Glu

E

 

к-та

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Фенилаланин

 

 

COO

Фен

Phe

F

Н

 

+

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

H3N

 

C

 

H

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CH2

 

 

 

 

Глутамин

NH2-C(=O)-(CH2)2CH(NH2)-COOH

Глн

Gln

Q

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Тирозин

 

 

COO

Тир

Tyr

Y

ПЗ

 

+

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

H3N

 

C

 

H

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CH2

 

 

 

 

OH

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-48-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 5 Аминокислотный состав белков

Окончание табл.5.1

Название

Структура

 

 

 

 

 

 

 

3-х

3-х

1-букв.

**

 

(R-CH(NH2)-COOH)

букв.

букв.

межд.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

межд.

межд.

обозн.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

обозн.

обозн.

 

 

Триптофан

 

 

COO

Три

Trp

W

Н

 

+

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

H3N

 

C

 

 

H

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CH2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

NH

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Гистидин

HN+

 

 

 

 

 

 

 

Гис

His

H

Н

 

 

 

 

 

 

 

 

 

—CH2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

NH

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Пролин

 

 

 

СOO

Про

Pro

P

 

 

+

 

 

 

 

 

 

H

 

 

 

 

 

H2N

 

 

 

 

 

 

СH2

 

 

 

 

 

H2C

 

 

 

 

 

 

СH2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Примечание: ** − Н незаменимая; ПЗ − полузаменимая; остальные – заменимые.

Аминокислоты классифицируются по:

1) строению; 2) характеру заряженности; 3) заменимостинезаменимости.

Классификация по строению:

1.моноаминомонокарбоновые

2.диаминомонокарбоновые (лизин, аргинин, цитруллин)

3.моноаминодикарбоновые (аспарагиновая и глутаминовая кислоты)

4.диаминодикарбоновые (цистин).

Название аминокислот по номенклатуре IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry − Международный союз чистой и прикладной химии) формируется так, как у карбоновых кислот вообще, с перечислением заместителей, например, имеющихся в углеродной цепи. Лизин, имеющий строение NH2-(CH2)4CH(NH2)-COOH будет называться 2,6- диаминогексановой, серин − 2-амино-3-гидроксипропановой. На практике названия по номенклатуре IUPAC по отношению к протеиногенным аминокислотам не применяют, обходясь исторически сложившимися тривиальными названиями. Исключение составляют лишь аспарагиновая и глутаминовая кислоты, для которых часто используют названия «аспартат» и «глутамат».

Очень важным свойством аминокислот является строение бокового радикала R, поскольку остальная часть молекулы, включающая карбоксильную группу, аминогруппу, ассиметричный атом углерода и водород для всех протеиногенных аминокислот совершенно одинакова: CH(NH2)-COOH.

Наличие в боковом радикале R функциональных групп, таких, как сульфгидрильная –SH, карбаминовая H2N-C(=O)-, гидроксильная HO-, ами-

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-49-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 5 Аминокислотный состав белков

ногруппа H2N-, карбоксильная HOOC- и другие, оказывает решающее влияние не только на формирование вторичной, третичной и четвертичной структур белковой молекулы, но и на ее биологические функции. В водных средах при различных значениях рН эти группы отвечают за величину электрических зарядов белковой молекулы, ее растворимость и ряд других физикохимических свойств. Например, замена одного аминокислотного остатка (глутаминовой кислоты в положении 6) в полипептидной цепи субъединицы гемоглобина на остаток валина приводит к такому изменению свойств молекулы гемоглобина, что это вызывает патологию, называемую «серповидноклеточной анемией».

По характеру заряженности боковых радикалов аминокислоты подразделяют на:

неполярные гидрофобные (Гли, Ала, Вал, Лей, Иле, Про, Фен, Тир, Три, Мет);

полярные, но незаряженные (Сер, Тре, Цис, Асн, Глн); полярные с отрицательным зарядом (Асп, Глу); полярные с положительным зарядом (Лиз, Арг, Гис).

В зависимости от того, могут ли аминокислоты синтезироваться в организме или должны поступать в составе пищи, различают:

заменимые; незаменимые (лейцин, изолейцин, валин, лизин, гистидин, метионин,

фенилаланин, треонин, триптофан). В детском возрасте также незаменимой является аминокислота аргинин.

Для человека Арг, Тир − полузаменимые, а для курицы − незаменимые.

Лекция6 Уровниструктурнойорганизациибелков

Структурнаяорганизациябелков

Каждый белок характеризуется специфической аминокислотной последовательностью и индивидуальной пространственной структурой (конформацией). На долю белков приходится не менее 50% сухой массы органических соединений животной клетки. В организме человека насчитывается до 5 млн. различных видов белков. Белковая молекула может состоять из одной или нескольких цепей, содержащих от пятидести до нескольких сотен (иногда более тысячи) аминокислотных остатков. Молекулы, содержащие менее пятидесяти остатков, относят к пептидам. В состав многих молекул входят остатки цистеина, дисульфидные связи которых ковалентно связывают участки одной или нескольких цепей. В нативном состоянии белковые макромолекулы обладают специфической конформацией. Характерная для данного белка конформация определяется последовательностью аминокислотных остатков и стабилизируется водородными связями между пептидными и

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-50-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 6 Уровни структурной организации белков

боковыми группами аминокислотных остатков, а также электростатическими и гидрофобными взаимодействиями.

Первичнаяструктурабелка: методыисследования. Структурныеособенностипептиднойсвязи

Пептидная связь образуется при реакции аминогруппы одной аминокислоты и карбоксильной группы другой с выделением молекулы воды:

СН3-СН(NH2)-COOH + CH3— СН(NH2)-COOH → СН3-СН(NH2)-CO- NH-(CH3) СН-COOH + H2O

Связанные пептидной связью аминокислоты образуют полипептидную цепь. Пептидная связь имеет плоскостную структуру: атомы С, О и N находятся в sp2-гибридизации; у атома N имеется р-орбиталь с неподеленной парой электронов; образуется р-π-сопряженная система, приводящая к укорочению связи СN (0,132 нм) и ограничению вращения (барьер вращения составляет 63 кДж/моль). Пептидная связь имеет преимущественно транс— конфигурацию относительно плоскости пептидной связи. Подобное строение пептидной связи сказывается на формировании вторичной и третичной структуры белка. Пептидная связь жесткая, ковалентная, генетически детерминированная. В структурных формулах изображается в виде одинарной связи, однако на самом деле эта связь между углеродом и азотом носит характер частично двойной связи:

60% 40%

Это вызвано различной электроотрицательностью атомов С, N и O. Вокруг пептидной связи вращение невозможно, все четыре атома лежат в одной плоскости, т.е. компланарны. Вращение же других связей вокруг полипептидного остова достаточно свободно.

Первичная структура была открыта профессором Казанского университета А.Я. Данилевским в 1989 г. В 1913 году Э. Фишером были синтезированы первые пептиды. Последовательность аминокислот для каждого белка уникальна и закреплена генетически.

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-51-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 6 Уровни структурной организации белков

 

 

 

H

 

O

 

N — Конец NH2 — CH2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

— C — N —

CH —

C — N —

CH — COOH C — Конец

 

 

 

 

 

СH3

 

 

 

 

 

 

 

O

 

 

H

(CH2)4NH2

Трипептид: глицилаланиллизин

Для определения первичной структуры отдельной, химически гомогенной полипептидной цепи методом гидролиза выясняют аминокислотный состав: соотношение каждой из двадцати аминокислот в образце гомогенного полипептида. Затем приступают к определению химической природы концевых аминокислот полипептидной цепи, содержащей одну свободную NH2— группу и одну свободную СООН-группу.

Для определения природы N-концевой аминокислоты предложен ряд методов, в частности, метод Сэнжера (за его разработку Ф. Сэнжер был удостоен Нобелевской премии в 1958 г.). Этот метод основан на реакции арилирования полипептида 2,4-динитрофторбензолом. Раствор полипептида обрабатывают 2,4-динитрофторбензолом, который взаимодействует со свободной α-аминогруппой пептида. После кислотного гидролиза продукта реакции только одна аминокислота оказывается связанной с реактивом в виде 2,4- динитрофениламинокислоты. В отличие от других аминокислот она имеет желтый цвет. Ее выделяют из гидролизата и идентифицируют методом хроматографии.

Для определения С-концевой аминокислоты часто используют ферментативные методы. Обработка полипептида карбоксипептидазой, которая разрывает пептидную связь с того конца пептида, где содержится свободная СООН-группа, приводит к освобождению С-концевой аминокислоты, природа которой может быть идентифицирована методом хроматографии. Существуют и другие методы определения С-концевой аминокислоты, в частности, химический метод Акабори, основанный на гидразинолизе полипептида.

Следующий этап работы связан с определением последовательности аминокислот в полипептиде. Для этого вначале проводят частичный (химический и ферментативный) гидролиз полипептидной цепи на короткие пептидные фрагменты, последовательность которых может быть точно определена. После гидролиза с помощью электрофореза и хроматографии составляют пептидные карты. Затем устанавливают последовательность аминокислот в выделенных пептидах и первичную структуру всей молекулы.

Номенклатурапептидовиполипептидов. Природныепептиды: глутатион, карнозин, ансерин, грамицидинS, окситоцин, энкефалины

Пептиды природные или синтетические соединения, молекулы которых построены из остатков α-аминокислот, соединенных пептидными (амидными) связями. Пептиды могут содержать также неаминокислотную компоненту. По числу аминокислотных остатков, входящих в молекулы пеп-

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-52-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 6 Уровни структурной организации белков

тидов, различают дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и т.д. Пептиды, содержащие до десяти аминокислотных остатков, называются олигопептидами, содержащие более десяти аминокислотных остатков – полипептидами. Природные полипептиды с молекулярной массой более 6000 называются белка-

ми.

Аминокислотный остаток пептидов, несущий свободную α- аминогруппу, называется N-концевым, а остаток, несущий свободную α- карбоксильную группу – С-концевым. Название пептида образуется из названий входящих в его состав аминокислотных остатков, перечисляемых последовательно, начиная с N-концевого. При этом используют тривиальные названия аминокислот, в которых суффикс «ин» заменяется на «ил». Исключение составляет C-концевой остаток, название которого совпадает с названием соответствующей аминокислоты. Все аминокислотные остатки, входящие в пептиды, нумеруются, начиная с N-конца. Для записи первичной структуры пептида (аминокислотной последовательности) широко используют трех- и однобуквенные обозначения аминокислотных остатков (например, Ala-Ser-Asp-Phe-GIy – это аланил-серил-аспарагил-фенилаланил- глицин).

Отдельныепредставителипептидов

Глутатион — трипептид γ-глутамилцистеинилглицин, содержащийся во всех животных и растительных клетках, бактериях.

α β γ

H2N — CH — CH2 — CH2 — CO— NH — CH — CO — NH — CH2— COOH

COOH

CH2SH

 

Глутатион

Глутатион участвует в ряде окислительно-восстановительных процессов. Он выполняет функцию антиоксиданта. Это обусловлено наличием в его составе цистеина и определяет возможность существования глутатиона в восстановленной и окисленной формах.

2 глу — цис — гли

2H

глу — цис — гли

 

 

+ 2H

 

SH

S

 

 

 

 

 

 

 

S

 

 

глу — цис — гли

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-53-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 6 Уровни структурной организации белков

Карнозин (от лат. carnosus мясной, caro мясо), C9H14O3N4, – дипеп-

тид (β-аланилгистидин), состоящий из аминокислот β-аланина и L-гистидина. Открыт в 1900 г. В. С. Гулевичем в мясном экстракте. Молекулярная масса 226, кристаллизуется в виде бесцветных игл, хорошо растворим в воде, нерастворим в спирте. Содержится в скелетной мускулатуре большинства позвоночных. Среди рыб встречаются виды, у которых карнозин и составляющие его аминокислоты отсутствуют (либо присутствует только L-гистидин или только β-аланин). В мышцах беспозвоночных карнозина нет. Содержание карнозина в мышцах позвоночных колеблется обычно от 200 до 400 мг% их сырой массы и зависит от их структуры и функции; у человека около

100-150 мг%.

Карнозин (β-аланил-L-гистидин) Ансерин (β-аланил-1-метил- L-гистидин)

Влияние карнозина на биохимические процессы, протекающие в скелетных мышцах, разнообразно, однако окончательно биологическая роль карнозина не установлена. Добавление карнозина к раствору, омывающему мышцу изолированного нервно-мышечного препарата, вызывает восстановление сокращений утомлённой мышцы.

Дипептид ансерин (N-метилкарнозин или β-аланил-1-метил- L- гистидин), сходный по строению с карнозином, в мышцах человека отсутствует, но имеется в скелетных мышцах тех видов, мышцы которых способны к быстрым сокращениям (мышцы конечностей кролика, грудная мышца птиц). Физиологические функции β-аланил-имидазольных дипептидов не вполне ясны. Возможно, они выполняют буферные функции и поддерживают рН в скелетной мышце, сокращающейся в анаэробных условиях. Однако ясно, что карнозин и ансерин стимулируют АТР-азную активность миозина in vitro, увеличивают амплитуду мышечного сокращения, предварительно сниженную утомлением. Академик С.Е. Северин показал, что имидазолсодержащие дипептиды не влияют непосредственно на сократительный аппарат, но увеличивают эффективность работы ионных насосов мышечной клетки. Оба дипептида образуют хелатные комплексы с медью и способствуют поглощению этого металла.

Антибиотик грамицидин S выделен из Bacillus brevis и представляющий собой циклический декапептид:

Грамицидин S

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-54-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 6 Уровни структурной организации белков

В структуре грамицидина S имеются 2 остатка орнитина, производные аминокислоты аргинина и 2 остатка D-изомеров фенилаланина.

Окситоцин − гормон, вырабатываемый нейросекреторными клетками передних ядер гипоталамуса и затем переносимый по нервным волокнам в заднюю долю гипофиза, где он накопляется и откуда выделяется в кровь. Окситоцин вызывает сокращение гладких мышц матки и в меньшей степени − мышц мочевого пузыря и кишечника, стимулирует отделение молока молочными железами. По химической природе окситоцин − октапептид, в молекуле которого 4 остатка аминокислот связаны в кольцо цистином, соединённым также с трипептидом: Pro-Leu-Gly.

окситоцин

Рассмотрим нейропептиды (опиатные пептиды). Первые два предста-

вителя нейропептидов, названные энкефалинами, были выделены из мозга животных:

Тир — Гли — Гли — Фен — Мет- Мет-энкефалин Тир — Гли — Гли — Фен — Лей- Лей-энкефалин

Эти пептиды обладают обезболивающим действием и используются как лекарственные средства.

Вторичнаяструктурабелков: α-спираль, ееосновные характеристики, β-структура, β-изгиб. Рольводородныхсвязейв

формированиивторичнойструктуры. Сверхвторичные(надвторичные) структурыбелка

Вторичная структура − это пространственное расположение полипептидной цепочки в виде α-спирали или β-складчатости безотносительно к типам боковых радикалов и их конформации.

Л. Полинг и Р. Кори предложили модель вторичной структуры белка в виде α-спирали, в которой водородные связи замыкаются между каждой первой и четвертой аминокислотой, что позволяет сохранять нативную структуру белка, осуществлять простейшие функции, защищать от разрушения. В образовании водородных связей принимают участие все пептидные группы,

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-55-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 6 Уровни структурной организации белков

что обеспечивает максимальную стабильность, снижает гидрофильность и увеличивает гидрофобность белковой молекулы. α-спираль образуется самопроизвольно и является наиболее устойчивой конформацией, отвечающей минимуму свободной энергии.

Наиболее распространенным элементом вторичной структуры является правая α-спираль (αR). Пептидная цепь здесь изгибается винтообразно. Ha каждый виток приходится 3,6 аминокислотного остатка, шаг винта, т.е. минимальное расстояние между двумя эквивалентными точками, составляет 0,54 нм; α-спираль стабилизирована почти линейными водородными связями между NH-группой и СО-группой четвертого по счету аминокислотного остатка. Таким образом, в протяженных спиральных участках каждый аминокислотный остаток принимает участие в формировании двух водородных связей. Неполярные или амфифильные α-спирали с 5-6 витками часто обеспечивают заякоривание белков в биологических мембранах (трансмембранные спирали). Зеркально-симметричная относительно αR-спирали левая α- спираль (αL) встречается в природе крайне редко, хотя энергетически возможна. Закручивание полипептидной цепи белка в спиралеобразную структуру происходит вследствие взаимодействия между кислородом карбонильной группы i-того аминокислотного остатка и водородом амидогруппы (i+4)- аминокислотного остатка посредством образования водородных связей

(рис.6.1).

Рис. 6.1. Вторичная структура белка: α-спираль

Другая форма спирали присутствует в коллагене, важнейшем компоненте соединительных тканей. Это левая спираль коллагена с шагом 0,96 нм и при остатке в 3,3 в каждом витке более пологая по сравнению с α- спиралью. В отличие от α-спирали образование водородных мостиков здесь

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-56-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 6 Уровни структурной организации белков

невозможно. Структура стабилизирована за счет скручивания трех пептидных цепей в правую тройную спираль.

Наряду с α-спиралями в образовании вторичной структуры белка принимают также участие β-структуры, β-изгиб.

В отличие от конденсированной α-спирали β-слои почти полностью вытянуты и могут располагаться как параллельно, так и антипараллельно

(рис.6.2).

а) б)

Рис. 6.2. Параллельное (а) и антипараллельное (б) расположение β-слоев

B складчатых структурах также образуются поперечные межцепочечные водородные связи (рис.6.3). Если цепи ориентированы в противоположных направлениях, структура называется антипараллельным складчатым листом (βα); если цепи ориентированы в одном направлении, структура называется параллельным складчатым листом (βn). В складчатых структурах α-С- атомы располагаются на перегибах, а боковые цепи ориентированы почти перпендикулярно средней плоскости листа, попеременно вверх и вниз. Энергетически предпочтительной оказывается βα-складчатая структура с почти линейными H-мостиками. В растянутых складчатых листах отдельные цепи чаще всего не параллельны, а несколько изогнуты относительно друг друга.

Рис. 6.3. β-складчатая структура

Кроме регулярных в полипептидных цепях есть еще и нерегулярные вторичные структуры, т.е. стандартные структуры, не образующие длинных периодических систем. Это – β-изгибы они называются так потому, что часто стягивают верхушки соседних β-тяжей в антипараллельных β-шпильках). В изгибы обычно входит около половины остатков, не опавших в регулярные структуры белков.

Супервторичная структура − это более высокий уровень организации белковой молекулы, представленный ансамблем взаимодействующих между собой вторичных структур:

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-57-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 6 Уровни структурной организации белков

1.α-спираль − два антипараллельных участка, которые взаимодействуют гидрофобными комплементарными поверхностями (по принципу «впади- на-выступ»);

2.сверхспирализация α-спирали;

3.βхβ − два параллельных участка β-цепи;

4.β-зигзаг.

Встречаются разнообразные способы укладки белковой цепи (рис. 6.5). Рисунок 6.5 взят с обложки журнала Nature 1977 г. (v.268, №.5620), где была напечатана статья Дж. Ричардсона о мотивах укладки белковых цепей.

Домен – компактная глобулярная структурная единица внутри полипептидной цепи. Домены могут выполнять разные функции и подвергаться свертыванию в независимые компактные глобулярные структурные единицы, соединенные между собой гибкими участками внутри белковой молекулы.

Третичнаяструктурабелков. Типынековалентныхсвязей, стабилизирующихтретичнуюструктуру. РольS-S-мостиков вформированиитретичнойструктурынекоторыхбелков

Под третичной структурой понимают пространственное расположение полипептидной цепи (способ укладки цепи в определенном объеме). В стабилизации пространственной структуры основную роль играют некова-

лентные связи. К ним относятся водородные связи, электростатические взаимодействия заряженных групп, межмолекулярные ван-дер-ваальсовы силы, взаимодействия неполярных боковых радикалов аминокислот (гидрофобные взаимодействия), диполь-дипольные взаимодействия. Кроме того, важную роль в формировании третичной структуры играют дисульфидные связи (S-S-мостики) (рис.6.4).

Рис. 6.4. Связи, стабилизирующие третичную структуру белка: а) электростатические силы; б) водородная связь; в) гидрофобное взаимодействие; г) диполь-дипольные взаимодействия; д) дисульфидная связь

Дисульфидные связи образуются при окислении сближенных в пространственной структуре белка остатков цистеина в остатки цистина. Счита-

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-58-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 6 Уровни структурной организации белков

ют, что дисульфидные связи, часто множественные, особенно важны для стабилизации маленьких белков, в которых не может возникнуть обширной системы нековалентных взаимодействий.

Третичная структура – уникальное для каждого белка расположение в пространстве полипептидной цепи, зависящее от количества и чередования аминокислот, т.е. предопределенное первичной структурой белка. Конфигурация белковых молекул может быть фибриллярной и глобулярной. Третичная структура многих белков составляется из нескольких компактных глобул, называемых доменами. Между собой домены обычно бывают связаны тонкими перемычками вытянутыми аморфными полипептидными цепями

(рис.6.5).

Рис. 6.5. Характерные мотивы укладки белковой цепи

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-59-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 6 Уровни структурной организации белков

Кроме того, в белках встречаются мотивы укладки полипептидной цепи, похожие на орнаменты на индейских и греческих вазах: мотив меандра, мотив греческого ключа, мотив зигзага-«молнии» (рис. 6.6).

При свертывании белковой глобулы значительная часть (не менее половины) гидрофобных радикалов аминокислотных остатков оказывается скрытой от контакта с окружающей белок водой. Происходит образование своеобразных внутримолекулярных «гидрофобных ядер». В них особенно представлены объемные остатки лейцина, изолейцина, фенилаланина, валина.

Рис.6.6. Мотивы укладки белковой цепи и орнаменты на индейских и греческих вазах. Вверху: мотив меандра; в середине: мотив греческого ключа; внизу: мотив зигзага- «молнии»

С появлением третичной структуры у белка появляются новые свойства – биологические. В частности, проявление каталитических свойств связано с наличием у белка третичной структуры. И наоборот, нагревание белков, приводящее к разрушению третичной структуры (денатурация), приводит и к утрате биологических свойств.

Четвертичнаяструктурабелков. Количествоитипысубъединиц. заимодействиямеждусубъединицами, стабилизирующиечетвертичную структуру. Функциональноезначениечетвертичнойструктурыбелков

Четвертичная структура − это надмолекулярное образование, состоящее из двух и более полипептидных цепей, связанных между собой нековалентно, а водородными связями, электростатическими, дипольдипольные и гидрофобными взаимодействиями между остатками аминокис-

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-60-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 6 Уровни структурной организации белков

лот, находящихся на поверхности. Примером может служить молекула гемоглобина, вирус табачной мозаики (2130 субъединиц).

Каждый из белков-участников третичной структуры при образовании четвертичной структуры называют субъединицей или протомером. Образовавшуюся молекулу называют олигомером, или мультимером. Олигомерные белки чаще построены из четного количества протомеров с одинаковыми или разными молекулярными массами. В образовании четвертичной структуры белка принимают участие те же связи, что и при образовании третичной структуры, за исключением ковалентных.

Объединение белковых молекул третичной структуры без появления новых биологических свойств называют агрегированным состоянием. Как четвертичная структура, так и агрегированное состояние могут быть обратимо разрушены с применением детергентов, в частности, додецилсульфата натрия или неионных детергентов типа тритона. Очень часто для разрушения четвертичной структуры исследуемый белок нагревают при 100°С в присутствии 1%-ного 2-меркаптоэтанола и 2%-ного додецилсульфата натрия. В таких условиях восстанавливаются -S-S-связи между остатками Cys, которые в некоторых случаях удерживают субъединицы четвертичной структуры.

Субъединицы, образующие четвертичную структуру белка, могут быть различными как по строению, так и по функциональным свойствам (гетеромеры). Это позволяет объединить в одной структуре несколько взаимосвязанных функций, создать полифункциональную молекулу. Например, в протеинкиназе, стехиометрия червертичной структуры которой отвечает формуле С2R2, субъединица С ответственна за ферментативную активность, осуществляя перенос фосфатного остатка от АТР на белок; субъединица R является регуляторной. В отсутствие циклического АМР последняя связана с С- субъединицей и ингибирует ее. При образовании комплекса с сАМР четвертичная структура распадается и С-субъединицы оказываются способными фосфорилировать белковые субстраты. В гомомерных белках субъединицы одинаковы.

Подавляющая часть белков, имеющих четвертичную структуру, приходится на димеры, тетрамеры и гексамеры, последние встречаются у белков с молекулярной массой, большей 100 кДа.

Характерной особенностью белков с четвертичной структурой является их способность к самосборке. Взаимодействие протомеров осуществляется с высокой специфичностью, благодаря образованию десятка слабых связей между контактными поверхностями субъединиц, поэтому ошибки при формировании четвертичной структуры белков исключены.

Практически все белки-ферменты имеют четвертичную структуру и состоят, как правило, из четного числа протомеров (двух, четырех, шести, восьми). Четвертичная структура белка подразумевает такое объединение белков третичной структуры, при котором появляются новые биологические свойства, не характерные для белка в третичной структуре. В частности, такие эффекты, как кооперативный и аллостерический, характерны лишь для белков с четвертичной структурой.

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-61-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 6 Уровни структурной организации белков

Четвертичная структура – последний уровень в организации белковой молекулы, причем не обязательный – до половины известных белков ее не имеют.

Лекция7 Физико-химическиесвойствабелков

Ионизация, гидратация, растворимость, осмотическиеионкотическиесвойства, оптическиесвойства

Физико-химические свойства белков зависят в основном от свойств боковых радикалов аминокислот, входящих в их состав, а также от количества свободных функциональных групп, в том числе аминных и карбоксильных, которые не были использованы для образования пептидных связей. Белки характеризуются высокой вязкостью растворов, незначительной диффузией, способностью к набуханию в больших пределах, оптической активностью, подвижностью в электрическом поле, низким осмотическим и высоким онкотическим давлением, способностью к поглощению УФ-лучей при 280 нм (это свойство, обусловленное наличием в белках ароматических аминокислот, используется для количественного определения белков).

Многие белки хорошо растворяются в воде, что обусловлено наличием на поверхности белковой молекулы свободных гидрофильных групп (– OH, – NH2, – COOH и др.). Растворимые белки гидрофильные коллоиды, активно связывающие воду; их растворы обладают значительной вязкостью, низким осмотическим давлением. Различные белки растворяются по-разному. Белки опорных тканей (кератин, проколлаген, коллаген, эластин и др.) нерастворимы в воде. Растворимость белка в воде зависит от характера белка, реакции среды и присутствия электролитов. В кислой среде лучше растворяются белки, обладающие кислыми свойствами (альбумины, глобулины, проламины, глютелины); щелочные белки (протамины, гистамины) лучше растворяются в щелочной среде. Различия в растворимости отмечаются как среди кисло-, так и среди щелочнореагирующих белков. Альбумины растворяются в дистиллированной воде, а глобулины растворяются в воде только в присутствии электролитов. Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных NH2— и СООН-групп. Для них характерны все свойства кислот и оснований. В зависимости от реакции среды и соотношения кислых и основных аминокислот белки в растворе несут отрицательный или положительный заряд, перемещаясь к аноду или катоду. Это свойство используется при очистке белков методом электрофореза.

Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами. Молекулы белка не способны проникать через полупроницаемые искусственные мембраны (целлофан, пергамент, коллодий), а также биомембраны растительных и животных тканей.

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-62-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 7 Физико-химические свойства белков

Характерной константой белков является изоэлектрическая точка – pI. В изоэлектрической точке суммарный заряд белков, обладающих амфотерными свойствами, равен нулю и белки не перемещаются в электрическом поле. Зная аминокислотный состав белка, можно приближенно определить изоэлектрическую точку. Изоэлектрическая точка большинства белков животных тканей лежит в пределах от 5,5 до 7,0, что свидетельствует о частичном преобладании кислых аминокислот. Однако в природе имеются белки, у которых значения изоэлектрических точек лежат в крайних значениях рН среды. В частности, величина рI пепсина (фермент желудочного сока) равна единице, сальмина (основной белок из молоки семги) – почти двенадцати.

Визоэлектрической точке белки наименее устойчивы в растворе и легко выпадают в осадок. Изоэлектрическая точка белка в сильной степени зависит от присутствия в растворе ионов солей; в то же время на ее величину не влияет концентрация белка.

Вхимии белков существует понятие «изоионная точка белка». Раствор белка называется изоионным, если он не содержит никаких других ионов, кроме ионизированных остатков аминокислот белковой молекулы и ионов, образующихся при диссоциации воды. Для освобождения белка от посторонних ионов его раствор обычно пропускают через колонку, наполненную смесью анионо- и катионообменников. Изоионной точкой данного белка принято называть значение рН изоионного раствора этого белка:

[H+] + [P] · Z = [OH],

где [Р] – молярная концентрация белка; Z – средний заряд молекулы. Согласно этому уравнению, изоионная точка белка зависит от его кон-

центрации. Очевидно, поэтому белок, за исключением случая, когда рI равно семи, не может быть одновременно изоэлектрическим и изоионным.

Белки обладают оптической активностью (способностью вещества вращать плоскость поляризации проходящего через него света), поскольку состоят из аминокислот, которые являются энантиомерами.

Все белки, как правило, поглощают ультрафиолетовый свет. На этом свойстве основан спектрофотометрический метод определения белков (по интенсивности поглощения при 280 нм). Обусловлено поглощение в УФ области спектра присутствием в белке ароматических аминокислот – Trp, Tyr, Phe. Условно принято, одна единица оптической плотности раствора при 280 нм соответствует концентрации белка, равной примерно 1 мг/мл (при толщине кюветы 1 см).

Белковые растворы обладают также способностью флуоресцировать – испускать квант света при переходе из электронно-возбужденного состояния в основное. Флуоресцирующими аминокислотными остатками в белках яв-

ляются Trp, Tyr, Phe.

В видимом диапазоне (380-780 нм) можно определять содержание окрашенных белков – хромопротеинов (гемоглобина, цитохромов и др.). В инфракрасной области спектра (780-10000 нм) поглощают все белки. ИК-

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-63-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 7 Физико-химические свойства белков

спектры используют для определения α-спиральных, β-структурных и аморфных участков в белковых молекулах.

Для растворов белка характерен эффект Тиндаля – рассеивание света белковыми частицами (при боковом освещении виден светящийся конус).

Молекулярнаямассаиразмерыбелков. Методыопределения молекулярноймассыбелков. Необходимостьприменениякомплекса методовдляточнойоценкимолекулярноймассыбелков

Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав которых входят сотни и даже тысячи аминокислотных остатков, объединенных в макромолекулярную структуру. Молекулярная масса белков колеблется от 6000 (нижний предел) до 1000000 и выше в зависимости от количества отдельных полипептидных цепей в составе единой молекулярной структуры белка. Такие полипептидные цепи называются субъединицами. Их молекулярная масса варьирует в широких пределах: от 6000 до 100000 и более. Для выражения молекулярной массы белков используют также специальную единицу – дальтон.

Дальтон (Да) – единица массы, практически равная массе атома водорода (т.е. 1,0000 по шкале атомных масс). Терминами «дальтон» и «молекулярная масса» пользуются как взаимозаменяемыми: например, белок в 20000 дальтон имеет молекулярную массу 20000. Наименование дано в честь Джона Дальтона, разработавшего атомарную теорию строения материи. Килодальтон (кДа) – единица массы, равная 1000 дальтон. Масса большинства белков лежит в пределах от 10 до 100 кДа.

Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для огромного количества встречающихся в природе белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике чаще всего используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез.

При определении молекулярной массы белков методами седиментационного анализа используют аналитические ультрацентрифуги (первая ультрацентрифуга была сконструирована в 1923 г. Т. Сведбергом), в которых удается создать центробежные ускорения (g), в 200000 и более раз превышающие ускорение земного притяжения. Обычно молекулярную массу вычисляют по скорости седиментации молекул белка или седиментационному равновесию. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница «растворитель-белок» (регистрируется автоматически). Оптические свойства растворителя и белка используются при определении скорости седиментации; которую выражают через константу седиментации s, зависящую как от массы, так и от формы белковой частицы:

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-64-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 7 Физико-химические свойства белков

v

S = —— , ω2 · r

где v – скорость перемещения границы растворитель-белок, см/с; ω – угловая скорость ротора, рад/с; r – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка, см. Константа седиментации имеет размерность времени (ее выражают в секундах). Величина константы седиментации, равная 1·10–13 с, условно принята за единицу и названа сведбергом (S). Значения констант седиментации большинства белков лежат в пределах 1–50 S, хотя в ряде случаев эти значения превышают 100 S.

Для вычисления молекулярной массы, помимо константы седиментации, необходимы дополнительные сведения о плотности растворителя и белка и другие согласно уравнению Сведберга:

RTS

M = ————

D (1- v ρ)

где R – газовая постоянная, эрг/(моль·гр.); Т – абсолютная температура (по шкале Кельвина); S – константа седиментации; ρ – плотность растворителя; v – парциальный удельный объем молекулы белка; D коэффициент диффузии.

Определение молекулярной массы белков методом ультрацентрифугирования требует много времени и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны простые методы (гель-хроматография и электрофорез).

Гель-хроматографию проводят при заполнении колонки пористым гелем сефадекса. Через колонку пропускают ряд белков с известной молекулярной массой и строят график зависимости логарифма молекулярной массы от значений их элюционных объемов. Между логарифмом молекулярной массы белка, имеющего сферическую форму, и элюционным объемом существует прямая зависимость. Легко определить молекулярную массу исследуемого белка, зная его объем элюции.

Второй разновидностью этого метода является тонкослойная гельхроматография. Длина пробега белка через тонкий слой сефадекса находится в логарифмической зависимости от его молекулярной массы (рис.7.1).

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-65-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 7 Физико-химические свойства белков

Рис. 7.1. Зависимость между длиной пробега белковых частиц при гельхроматографии в тонком слое сефадекса G-150 и их молекулярными массами

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвижностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис.7.2).

Рис. 7.2. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле. присутствии додецилсульфата натрия

Электрофорез проводят в присутствии детергента – додецилсульфата натрия (SDS), т.к. только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость между логарифмом молекулярной массы и подвижностью белков.

Додецилсульфат натрия

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-66-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 7 Физико-химические свойства белков

Денатурациябелков

Природные белки имеют определенную, строго заданную пространственную конфигурацию и характерные физико-химические и биологические свойства при физиологических значениях температуры и рН среды. Под влиянием различных физических и химических факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя нативные свойства, т.е. денатурируют. Денатурация нарушение уникальной структуры нативной молекулы белка, ее третичной структуры, приводящее к потере характерных свойств (растворимость, электрофоретическая подвижность, биологическая активность и т.д.) (рис.7.3). Большинство белков денатурирует уже при нагревании их растворов выше 50–60°С.

Рис. 7.3. Денатурация белка: а) нативный белок; б) стадия обратимой денатурации; в) стадия необратимой денатурации

При денатурации происходит потеря растворимости белка, особенно в изоэлектрической точке, повышение вязкости белковых растворов, увеличение количества свободных функциональных SH-групп и изменение характера рассеивания рентгеновских лучей. Характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря белком его биологической активности (каталитической, антигенной или гормональной). При денатурации белка разрушаются в основном нековалентные связи (в частности, гидрофобные взаимодействия и водородные связи). Дисульфидные связи в присутствии восстанавливающего агента меркаптоэтанола разрываются, в то время как пептидные связи самого остова полипептидной цепи не затрагиваются. В этих условиях развертываются глобулы нативных белковых молекул и образуются случайные и беспорядочные структуры.

Денатурация белков с потерей биологической активности может происходить под действием высокой температуры, ультрафиолетового излучения, кислот, щелочей, ионов тяжелых металлов. Денатурация бывает обратимой (ренатурация) и необратимой.

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-67-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция8 Классификациябелков. простыеисложныебелки

Принципыклассификациибелков

В основу классификации белков положена их структурная организация. Наиболее полная классификация структур белков представлена в компьютерных классификаторах«Dali/FASS», сделанных Л. Холмом и К. Сандером; в классификаторах, сделанных в группе Дж. Торнтон «CATH» (Class- Architecture-Topology—Homology) и в классификаторе «SCOP» (Structural Classification of Proteins), созданном А.Г. Мурзиным.

Классификация относится к строению доменов (компактных глобул), существующих либо сами по себе, либо в составе многодоменного белка. Она начинается со структурного класса домена (α, β и т.д.). Классы подразделяются по архитектурным типам каркаса, сложенного из α- и/или β- участков; архитектуры подразделяются по топологиям прохождения цепи через каркас, т.е. по мотивам укладки цепи.

И уже далее мотивы подразделяются на суперсемейства, где просматривается хоть какая-то гомология (след общего происхождения) последовательностей, суперсемейства – на семейства с явно проявляющейся гомологией, и т.д. вплоть до отдельных белков конкретных организмов.

Физическая классификация белковых структур (класс-архитектура- топология) дает возможность не только систематизировать уже изученные структуры, но и предсказывать будущие открытия белковых структур. Так, долгое время были известны только такие β-белки, которые сложены из антипараллельной β-структуры, а на месте β-белков, сложенных из параллельной β-структуры зияла лакуна, но потом она заполнилась.

По химическому составу все белки делят на простые, состоящие только из аминокислотных остатков, и сложные. Сложные могут включать ионы металла (металлопротеины) или пигмент (хромопротеины), образовывать прочные комплексы с липидами (липопротеины), нуклеиновыми кислотами (нуклеопротеины), а также ковалентно связывать остаток фосфорной кислоты (фосфопротеины), углевода (гликопротеины).

Простые белки подразделяют на фибриллярные, растворимые в воде

(актин, миозин) и нерастворимые (кератин, эластин, коллаген), и глобулярные (альбумины, глобулины, протамины, гистоны, проламины).

Фибриллярныебелки

Коллагены, эластин, кератин относятся к нерастворимым фибриллярным белкам, которые составляют наружный покров тела животного и находятся в скелете и в соединительной ткани.

Коллагены широко распространены в живых организмах. Из них состоит соединительная ткань; они находятся в хрящах. Кости позвоночных жи-

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-68-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 8 Классификация белков. простые и сложные белки

вотных состоят из неорганических веществ (фосфорнокислого и углекислого кальция), жира и коллагенов. При кипячении с водой или действии перегретого водяного пара коллагены образуют клей. Если из костей извлечь жир и потом, обработав их кислотой, растворить фосфорнокислый кальций, останется белковое вещество – оссеин. При обработке оссеина перегретым водяным паром он переходит в клей. Чистый костяной клей называется желатиной. Особенно чистая желатина получается из рыбьего пузыря кипячением с водой.

Типичная молекула коллагена состоит из трех полипептидных целей разных типов (α-спиралей), скрученных в виде правой тройной спирали. Полипептидные цепи построены из часто повторяющихся фрагментов, имеющих характерную последовательность: -Gly-X-Y-. Каждым третьим аминокислотным остатком является глицин. Часто встречаются остатки пролина и 4-гидроксипролина. Молекула коллагена содержит остатки З- гидроксипролина и 5-гидроксилизина. Присутствие в полипептидной цепи остатков гидроксиаминокислот является характерной особенностью коллагена. На одном из концов молекула коллагена сшита поперечными связями, образованными боковыми цепями остатков лизина. Количество поперечных связей возрастает по мере старения организма. Известны 12 вариантов коллагена, характеризующихся различным сочетанием полипептидных α-цепей. Молекулы коллагенов обладают свойством спонтанно агрегировать с образованием более сложных структур, микрофибрилл и фибрилл. Большинство коллагенов образуют фибриллы цилиндрической формы диаметром 20-500 нм с характерными поперечными полосами, повторяющимися через каждые 6467 нм.

Эластин – основной белковый компонент, из которого состоят эластические волокна. Общим для коллагена и эластина является большое количество пролина и глицина, небольшое – метионина, отсутствие триптофана и цистеина. В отличие от коллагена в эластине много валина и аланина и меньше глутаминовой кислоты и аргинина. В целом, эластин характеризуется слишком малым количеством полярных аминокислотных остатков. Эластин входит в состав жил и других эластичных веществ соединительной ткани. Нити сырого шелка состоят из белкового вещества (фиброина), покрытого другим белковым веществом, играющим роль шелкового клея (серицином). При кипячении с водой шелк освобождается от клея, который при этом переходит в раствор.

Кератин является главной составной частью волос, рогов, копыт, ногтей, перьев и верхнего слоя кожи. Скорлупа куриного яйца состоит из извести и кератина. Если растворить известь скорлупы яйца в кислоте, останется мягкая кожа, состоящая из кератина; из кератина состоит кожица, которая следует за скорлупой яйца. По химическому составу кератин богат серой.

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-69-

МОДУЛЬ I. СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Лекция 8 Классификация белков. простые и сложные белки

Глобулярныебелки

Альбумины растворимы в воде, свёртываются при нагревании, нейтральны, сравнительно трудно осаждаются растворами солей. Примерами их могут служить альбумин белка куриного яйца, альбумин кровяной сыворотки, альбумин мышечной ткани, молочный альбумин. Поддерживают онкотическое давление плазмы крови, выполняют транспортные функции.

Глобулины нерастворимы в воде, но растворяются в очень слабых растворах солей. Более концентрированными растворами солей они вновь осаждаются; осаждение происходит при меньшей концентрации, чем та, которая необходима для осаждения альбуминов. Эти белки являются очень слабыми кислотами. Примерами глобулинов могут служить: фибриноген, глобулин кровяной сыворотки, глобулин мышечной ткани, глобулин белка куриного яйца. Выполняют транспортную и защитную функцию.

Гистоны белки основного характера. Находятся в составе нуклеопротеинов. В их состав входят лизин и аргинин, содержание которых не превышает 20-30%. Играют важную роль в регуляции экспрессии генов.

Протамины не содержат серы, обладают сравнительно сильными основными свойствами, обусловленными наличием в их составе аргинина (6085%). Протамины хорошо растворимы в воде, изоэлектрическая точка их лежит в щелочной среде, образуют кристаллические соли, содержатся (в виде нуклеопротеинов) в сперматозоидах рыб. Имеют небольшую молекулярную массу (до 5000).

Проламины и глютелины находятся в зернах различных хлебных злаков. Растворяются в 80%-ном этиловом спирте, в то время как остальные белки в этих условиях выпадают в осадок. Представителем этих белков может служить глиадин, составляющий главную часть клейковины.

Сложныебелки

Сложные белки – белки, содержащие прочно связанную небелковую часть молекулы, называемую простетической группой. В зависимости от природы простетической группы сложные белки подразделяются на ряд классов:

1)липопротеины (хиломикроны, липопротеины разной плотности);

2)гликопротеины (содержат остатки сахаров, масса белковой части превышает массу углеводной части);

3)протеогликаны (полисахариды, содержащие полипептидные участ-

ки);

4)фосфопротеины (казеин);

5)металлопротеины (ферритин);

6)хромопротеины (гемоглобин, цитохромы, миоглобин);

7)нуклеопротеины.

Биохимия и молекулярная биология. Конспект лекций

-70-



Источник: studfile.net

Читайте также
Вид:

Добавить комментарий